噬菌体治疗实验性小鼠耐亚胺培南铜绿假单胞菌感染的研究

目的探讨噬菌体治疗耐药性铜绿假单胞菌感染的疗效.方法以BALB/c小鼠为实验动物,建立耐药性铜绿假单胞菌全身感染模型,应用体外试验所筛选的宽噬噬菌体进行治疗.结果噬菌体在感染复数（multiple of infection,MOI）≥0.01时能有效杀灭铜绿假单胞菌,显著提高小鼠生存率.延迟治疗3 h仍有40%的生存率.结论通过对小鼠生存率、噬菌体在体内分布及机体对噬菌体的免疫反应等指标的观察分析,噬菌体制剂简捷高效,对机体正常组织无毒副作用,从而为临床治疗全身或局部铜绿假单胞菌感染提供了新途径.     

HLA-A*0201与EGFP融合蛋白表达载体的构建及其在K562细胞的表达和定位

目的:构建增强型绿色荧光蛋白(EGFP)与HLA-A^*0201(A^*0201)融合蛋白哺乳动物细胞表达载体,分析其在K562细胞中的表达和亚细胞定位。方法:以RT-PCR方法克隆A^*0201cDNA,构建A^*0201-EGFP融合蛋白表达载体,转染K562细胞,以流式细胞仪和激光共聚焦显微镜分析融合蛋白的表达及其亚细胞定位。结果:从两个HLA-A2阳性供者外周血细胞中克隆到A^*0201cDNA编码区全长序列。通过PCR方法在起始位点前加入Kozak序列并删除终止密码,成功构建A^*0201-EGFP融合蛋白表达载体。以该质粒转染K562细胞,5h后A^*0201和EGFP的表达百分率分别为25.12±2.26、27.37±3.59,24h后表达水平无明显提高。表达的融合蛋白主要分布于细胞膜上,胞内分布较少。相反,转染空载体的细胞不表达A^*0201分子,仅表达EGFP,且其在细胞内呈弥散样分布。结论:成功构建A^*0201-EGFP融合蛋白表达载体,并在K562细胞中得到表达,表达产物主要分布于细胞膜表面,提示表达该融合蛋白的K562细胞是潜在的人工抗原提呈细胞。     

HLA-A*0203-BSP的表达和复性及其四聚体的鉴定

目的：优化诱导条件大批量表达生物素化酶BirA底物肽（BSP）与HLA-A＊0203重链胞外域的融合蛋白（HLA—A＊0203、BSP），并制备负载HLA-A＊0203限制性EB病毒抗原肽EBNA3 596-604的四聚体（HIA—A}0203／SVR）。方法：以HLA—A＊0203-BSP原核表达载体转化E．coli BL21（DE3）菌株，优化诱导条件进行大批量重组蛋白的表达。通过稀释法复性可溶性HLA-A＊0203／SVR单体，然后以BirA对其进行生物素化，并以阴离子交换树脂纯化。将纯化的HLA-A＊0203／SVR单体与荧光素标记的链亲和素按4：1的比例混合形成四聚体，通过对特异性CTL进行染色验证其结合活性。结果：当IPTG的浓度为0．4mmol／L，于37℃诱导过夜后，融合蛋白的表达最多。该重组蛋白相对分子质量（Mr）为34003，与HLA—A＊0203-BSP的理论Mr相一致。该重组蛋白以包涵体形式存在于沉淀部分，约占菌体总蛋白的30％。负载抗原肽的可溶性HLA-A＊0203／SVR单体是在同时存在HLA-A＊0203，BSP、β2微球蛋白及HLA-A＊0203限制性抗原肽SVR的情况下通过稀释法复性而获得。该单体生物素化并纯化后与荧光素标记的链亲和素按4：1的比例混合后即形成四聚体。流式细胞术（FCM）分析证实，该四聚体具有与HLA—A2^＋供者特异性CTL结合的活性。结论：HLA—A＊0203-BSP融合蛋白在优化条件下获得高效表达。以此蛋白制备的HLA-A＊0203／SVR四聚体具有与HLA-A2^＋供者特异性CTL结合的活性，为研究HLA—A＊0203个体EB病毒特异性CTL的免疫应答打下了基础。     

血红蛋白单克隆抗体的制备及其特性研究

本文报告应用淋巴细胞杂交瘤技术制备了抗人血红蛋白单克隆抗体(Hb-McAb)。经实验证明，Hb—McAb局有特异性强，效价高、使用简便，安全等优点，可作为大肠癌早期诊断的初筛指标。     

RGD肽表面修饰壳聚糖载基因纳米粒子的体外实验研究

目的 将Arg-Gly-Asp(RGD)肽偶联到壳聚糖(cH)材料表面,并制备成包载质粒DNA的纳米粒子,以未偶连RGD的壳聚糖载质粒DNA作为对照,进行体外内皮细胞转染,观察其是否能提高对内皮细胞的转染效率.方法 以1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳化二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)为偶联剂,通过酰胺键将RGD肽偶联到壳聚糖表面,对其进行表征,并以未偶连RGD的壳聚糖作为对照,制备载pEGFP-C1质粒DNA纳米粒子,比较2者对Hy926细胞的转染效率.结果 壳聚糖-RGD(CH-RGD)载基因纳米粒子转染Hy926细胞的效率明显高于未偶连RGD的壳聚糖载基因纳米粒子(35.7%vs 14.3%,P<0.001).结论 RGD肽表面修饰壳聚糖载基因纳米粒子可用于体外细胞转染,其对细胞的转染效率明显优于未偶连RGD的壳聚糖.     

PD-L2剪切异构体与EGFP融合蛋白的表达及其亚细胞定位研究

目的　探讨PD L2的剪切异构体在哺乳动物细胞的表达和亚细胞定位。方法　以RT PCR方法克隆人PD L2基因的常规剪切体和新型剪切异构体的cDNA ,构建其与EGFP融合的表达载体 ,分别转染K5 6 2细胞进行表达 ,经抗PD L2抗体染色后以流式细胞仪和激光共聚焦显微镜分析融合蛋白的表达及其亚细胞定位。结果　从活化的人白细胞中克隆到常规剪切体PD L2Ⅰ和新型剪切异构体PD L2Ⅱ的cDNA ,后者删除了编码胞外区Ig C结构域的外显子 3。进而构建了PD L2Ⅰ EGFP和PD L2Ⅱ EGFP融合蛋白表达载体 ,分别转染K5 6 2细胞。流式细胞仪分析显示 ,转染前者的细胞中既可检测到EGFP的表达又可在细胞膜上检测到PD L2表达 ;而转染后者的细胞中只能检测到EGFP的表达 ,在其细胞膜上不能检测到PD L2表达。共聚焦显微镜观察显示 ,PD L2Ⅰ EGFP主要分布于细胞膜表面 ,PD L2Ⅱ EGFP则主要分布于细胞内。结论　常规剪切体PD L2Ⅰ能正确定位于细胞膜表面 ,而新型剪切异构体PD L2Ⅱ则位于细胞内 ,不能运输至细胞膜 ,提示不同PD L2剪切异构体可能与其功能的调变有关     

当真爱靠近

从国外回来,梅宇虽然凭着经济学硕士学位谋到一份职业,但落脚之处却成了问题,幸好有多年好友霜霜的仗义收留。     

新型mucA基因突变的铜绿假单胞菌生物被膜的形成和藻酸盐相关基因表达的研究

目的 确定黏液型铜绿假单胞菌PA17的mum基因突变位点，研究藻酸盐合成相关基因在其生物被膜形成过程中的表达，并观察PAl7生物被膜形成过程和形态。方法 PCR方法扩增铜绿假单胞菌PA17的mueA基因全长并测序；改良平板培养法建立PA17的生物被膜模型，半定量RT-PCR测定生物被膜形成24h、3d．6d时藻酸盐合成相关基因,algD、algU和algR的表达，并进行统计学分析；扫描电镜观察不同时间点的生物被膜形态。结果 PA17的mucA基因第166～333位核苷酸片段缺失，第342位A→G；其藻酸盐相关基因algD和algU均在生物被膜形成过程的第6天表达水平最高，algR在24h表达最高，单因素方差分析显示，上述基因在生物被膜形成过程不同时间点表达的差异有统计学意义；PA17于第6天形成成熟生物被膜，形态为薄膜状。结论 PA17是一株含新型mucA突变基因的黏液型铜绿假单胞菌，其藻酸盐相关基因在生物被膜形成的不同时间点的表达差异具有统计学意义，其生物被膜形态为薄膜状。     

医疗设备准入评估模型设计与实践

按照世界卫生组织医疗器械技术序列《采购流程与资源指南》中医疗器械标准购置流程,以微型卫生技术评估(Mini-HTA)、VAC价值分析评估以及项目评估模型为依据,建立了标准且完整的医疗设备医院层级准入评估模型。该模型主要包括技术评估、效益评估、安全评估以及附件因素评估等四项指标,以实际证据为依据,采用定性、定量相结合的方式对医疗设备进行评估。应用该模型,对医院2019年50万元以上医疗设备进行准入评估,认为可有效优化医院资源配置,为医疗设备购置决策提供依据。