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目的构建hsa-miR-26b沉默载体,与其靶基因PTEN共转染HEK-293T细胞验证其沉默效果。方法用miRNA海绵体技术设计并合成与hsa-miR-26b成熟序列反向互补的3个重复序列的双链DNA,将短发卡状RNA(shRNA)克隆入LV3-GFP-Puro载体,与靶基因PTEN共转染HEK-293T细胞,于24 h后收集细胞RNA,用real-time PCR检测hsa-miR-26b表达水平,同时用双荧光素报告系统检测其对靶基因的作用。结果成功构建了有效的hsa-miR-26b沉默载体,经测序验证与设计序列一致;real-time PCR验证hsa-miR-26b表达水平降低了75%;双荧光素报告系统验证其对靶基因无抑制作用(P>0.05)。结论成功构建hsa-miR-26b沉默载体,并验证其对靶基因PTEN无抑制作用。 相似文献
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目的探讨Hsa-miR-1在人类食管癌发病中的作用,并对其生物学特征及功能进行预测分析,从而为后续Has-mir-1功能的研究提供线索。方法通过实时荧光定量PCR法,检测人食管癌细胞株KYSE-150和正常食管上皮细胞株Het-1A中Hsa-miR-1的相对表达水平;应用miRBase获取、分析Hsa-miR-1序列特征并比较其同源性大小;应用HGNC、NCBI mapviewer、UCSC Browser工具分析Hsa-miR-1所在基因组特征;应用TargetScan6.1、PicTar及miRanda预测Hsa-miR-1的靶基因,取三者预测结果交集,并结合已证实的靶基因,进行功能注释(Gene Ontolo-gy)和通路富集分析(Pathway enrichment)。结果 KYSE150中Hsa-miR-1表达显著低于Het-1A细胞;Hsa-miR-1在物种进化上具有很强的保守性,其靶基因显著富集在癌症通路、与癌症发生相关的信号通路以及心肌通路中。结论 Hsa-miR-1可能参与了食管癌的发病机制,其预测靶基因集合富集于多个生物学过程并且显著富集于癌症通路;此为后续Hsa-miR-1生物学功能的研究奠定了基础。 相似文献