幽门螺杆菌4种黏附素基因保守区的克隆、序列及其生物信息学分析

目的克隆幽门螺杆菌(Helicobacterpylori, Hp)4种黏附素(BabA、AlpA、AlpB和HopZ)的保守区,并对其进行序列及生物信息学分析,为研究Hp黏附素的分子机制和免疫原性提供实验基础。方法利用ANTHEPROT V4.3c 软件分析已证实的Hp4种黏附素蛋白序列,发现共同保守区(命名为CB),推导出其DNA序列,设计CB特异引物,将PCR产物定向插入pET-22b(+)载体,构建保守区的重组克隆。DNA自动分析仪进行序列测定,生物信息学软件对其生物学特性进行分析。结果构建了4种黏附素共同保守区的重组质粒,测序显示CB基因长588 bp,该基因编码195个氨基酸,与4种黏附素保守区的同源性均达50%以上,ANTHEPROT V4.3c软件预测其蛋白质相对分子质量约为22 500,并显示出了良好的抗原性和疏水性。BLAST分析了836 767个序列,与其同源性达40%的均为Hp序列。结论Hp4种黏附素存在同源性接近的保守区,表明其黏附作用可能有相似的分子基础,生物信息学分析表明其具有优良的免疫原性和严格的种属特异性。     

幽门螺杆菌粘附素AlpA基因克隆、表达及免疫原性研究

目的 构建表达幽门螺杆菌(Hp)黏附素AlpA的候选菌株并研究其免疫原性。方法 利用PCR技术扩增粘附素AlpA基因，将其定向插入pET-22b( )载体，在BL21(DE3)大肠杆菌中表达并通过免疫印迹实验研究其免疫原性。结果 克隆的粘附素AlpA基因序列与基因库公布的基本一致，粘附素AlpA重组蛋白表达量占菌体总蛋白的31．9％，经免疫印迹证实该重组蛋白可被AlpA免疫兔血清和Hp,感染患者血清所识别。结论．AlpA克隆、高效表达及其免疫原性的初步证实，为Hp基因工程疫苗的研制和粘附机制的研究打下了基础。     

幽门螺杆菌长期感染蒙古沙土鼠导致胃炎、胃溃疡的实验研究

目的：用幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)长期感染蒙古沙土鼠建立胃炎、胃溃疡的动物模型。方法：蒙古沙土鼠经过禁食、禁水预处理之后，采用国际标准菌株H.pylori ATCC 43504灌胃，在末次灌胃动物后4，8，12，24，48，52周分别对H.pylori感染组和正常对照组蒙古沙土鼠的胃黏膜进行H.pylori形态学(涂片和细菌培养)、H.pylori快速尿素酶检测、H.pylori特异性PCR检测和病理组织学观察，并对血清中抗H.pylori IgG抗体进行了检测。结果：H.pylori感染组动物以上各项指标均为阳性，表明已经感染H.pylori；而正常对照组则以上各项均为阴性。病理组织学观察表明感染组8周即可见到慢性炎症性病变，12周时黏膜层和黏膜下层可见到淋巴滤泡，24周胃窦部可见到胃溃疡。结论：H.pylori ATCC 43504可以长期定植于蒙古沙土鼠腺胃，能够产生与H.pylori感染人胃黏膜相似的病理改变。     

肠毒素性大肠杆菌菌毛抗原CS6和霍乱毒素B亚基在人伤寒沙门菌中的共表达及其免疫学效果观察

目的：构建表达肠毒素性大肠杆菌菌毛抗原基因CS6和霍乱毒素B亚基（CTB）基因的细菌性腹泻基因工程多价疫苗。方法：以基因工程减毒的人伤寒沙门菌为抗原载体，利用基于asd基因功能互补的宿主染色体－质粒平衡致死表达系统，实现了在没有抗生素选择压力的条件下，CS6和CTB在人伤寒沙门菌中的稳定表达。结果与结论：检测结果表达，CS6和CTB的表达虽对宿主菌的生长有一定影响。但经过一段时间的培养，重组菌株仍可达到高密度生长，动物免疫结果显示，重组菌株在家兔体内均可诱生相应抗体，但从诱生的抗体效价，抗体持续时间方面评价，单独表达CS6与CTB的重组菌株的免疫学效果均好于两者共表达的重组菌株，提示在以后的疫苗研究实践中，可以考虑将分别表达CS6和CTB的重组菌株按一定比例混合，组成联合疫苗，用于细菌性腹泻的的免疫预防，本研究结果对于细菌性腹泻基因工程多价疫苗的构建有指导意义。     

HeLa细胞中细胞周期蛋白B不降解也能完成有丝分裂中后期转变

目的：在用细胞周期蛋白（ｃｙｃｌｉｎ）Ｂ１作为ＨｅＬａ细胞周期Ｇ１期时相的阴性标志物时，发现呈阳性结果，为此，对细胞周期蛋白Ｂ在细胞的Ｍ期向Ｇ１期过渡中的作用做进一步探讨。方法：分别用诺考达唑（ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）和离心淘洗的方法同步化ＨｅＬａ细胞，用Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹方法检测细胞周期蛋白Ｂ的存在。结果：用诺考达唑阻断细胞于Ｍ期，然后释放４ｈ所得的Ｇ１期细胞中有细胞周期蛋白Ｂ，而离心淘洗的方法所得Ｇ１期细胞中没有细胞周期蛋白Ｂ。结论：（１）诺考达唑阻断细胞于Ｍ期后，可影响细胞周期蛋白Ｂ１在Ｍ期后期的降解；（２）细胞周期蛋白Ｂ１的降解对于ＨｅＬａ细胞由Ｍ期向Ｇ１期过渡并不是必需的，可能还有别的蛋白质参与；（３）采用药物阻断的方法同步化细胞，对细胞的生理、生化活动有潜在的影响。     

ET重组:Escherichia coli中最新分子克隆方法

功能基因组研究的飞速发展推动了在E .coli中运用体内同源重组的方法进行DNA操作的技术革新步伐 ,ET体内重组方法具有应用范围广、操作灵活简便、重组效率高等优点 ,它可进行常规分子生物学无法实现的操作。这种方法不依赖于合适的限制酶切位点 ,能够在靶分子的任意位置上进行基因的插入、缺失和替换 ;能够直接进行亚克隆并且还可以从细菌人工染色体和基因组DNA片段中克隆所需DNA。本文所阐述的方法可应用于包括长DNA在内的任意大小DNA的修饰 ,并概括描述了基因调控研究的最新策略     

人源肠毒素大肠杆菌CS3伞毛抗原结构基因的克隆…

利用体外基因扩增技术（ＰＣＲ）和ＤＮＡ重组技术，扩增克隆了人源肠毒素大肠杆菌（ＥＴＥＣ）的ＣＳ３伞毛抗原的结构基因。核苷酸序列分析证实克隆的ＤＮＡ片段长度为６０４核苷酸对（ｂｐ）。在该序列中含有单个开放阅读框架，并具有－１０区和－３５区启动子序列以及核糖体结合位点。根据核苷酸序列推导，ＣＳ３结构基因编码１６８个氨基酸。其中前１５个氨基酸为可能的信号肽部分。在该基因编码的氨基酸中，疏水氨基酸约占４６     

幽门螺杆菌热休克蛋白A基因的克隆及论著高效分泌表达

目的 :从幽门螺杆菌 (Hp)分离热休克蛋白A基因 ,并实现在大肠杆菌中的融合分泌表达。方法 :提取Hp染色体DNA ,用PCR方法扩增hspA基因。经克隆、测序后 ,构建融合分泌表达载体 pMAL HspA ,转化大肠杆菌 ,IPTG诱导表达。 结果 :分离得到了高度保守的 354bp的hspA基因片段 ,并在大肠杆菌中实现了该基因的融合分泌表达。在 37℃诱导表达 3h后 ,其融合分泌表达蛋白可占细菌周质总蛋白的 66.6%。该表达带可被抗Hp的特异抗体所识别。 结论 :幽门螺杆菌hspA基因的克隆与表达为Hp疫苗的研制打下了基础。     

过氧化氢酶和黏附素保守区二价疫苗治疗小鼠幽门螺杆菌感染

目的:利用人类幽门螺杆菌(H.pylori)感染的小鼠模型研究过氧化氢酶和黏附素保守区二价疫苗治疗H.pylori感染的作用. 方法: 把已感染H.pylori的小白鼠分成7组, 分别通过灌胃方法给予过氧化氢酶和黏附素保守区(各100 μg)加霍乱毒素CT(2 μg)、过氧化氢酶(100 μg)加CT (2 μg)、黏附素保守区(100 μg)加CT (2 μg),PBS,单纯过氧化氢酶(100 μg)、单纯黏附素保守区(100 μg)、单纯CT (2 μg),1次/wk,共4次,治疗结束后4 wk处死动物,取胃黏膜行半定量细菌培养检查H.pylori情况. 结果: 治疗实验各组H.pylori根除率分别为: 过氧化氢酶和黏附素保守区加CT组69.2%(18/26)、过氧化氢酶加CT组30.8%(8/26)、黏附素保守区加CT组38.5%(10/26);生理盐水组、单纯过氧化氢酶、单纯黏附素保守区、单纯CT组根除率均为0%. 未根除H.pylori的小鼠,疫苗治疗组H.pylori的定植密度明显低于其他4组(P<0.05). 此外,二价疫苗组的H.pylori根除率及定植密度较单价疫苗组均有显著性差异(P<0.05). 结论: 由过氧化氢酶和黏附素保守区加免疫佐剂组成的二价口服疫苗较单价口服疫苗有更好的免疫治疗效果,多价疫苗是未来H.pylori疫苗的研制方向.     

酵母双杂交系统：探寻与内皮素受体相互作用的蛋白质

酵母双杂交系统：探寻与内皮素受体相互作用的蛋白质文立民张兆山黄翠芬军事医学科学院生物工程研究所北京１０００７１内皮素是近年来新发现的一种血管活性多肽。它是迄今所知体内最强烈、最持久的血管收缩因子，不仅可促进血管收缩，而且可刺激心血管系统的细胞增生及肥...