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31.
幽门螺杆菌粘附素基因hpaA的克隆及表达 总被引:2,自引:0,他引:2
目的 通过基因工程技术获得具有良好免疫原性的重组N-乙酰神经氨酰乳糖结合原纤维样血凝素(HpaA)。 方法 利用PCR技术从幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)总DNA中钓取hpaA结构基因,克隆及序列分析后在大肠杆菌中进行高效表达,表达产物经纯化后用酶联免疫吸附法(ELISA)检测其抗原性。结果 序列分析证实hpaA结构基因长度为783 bp,编码261个氨基酸,SDS-PAGE显示表达产物相对分子质量约为29 000,可溶性表达占全菌的20%以上,经硫酸铵分级沉淀和阴离子交换层析后获得纯度为90%的重组蛋白。ELISA法显示该蛋白可被Hp全菌抗血清识别。结论 基因重组粘附素HpaA具有良好的抗原性,可望作为一种有效的蛋白疫苗用于Hp感染的防治。 相似文献
32.
目的:为了提高幽门螺杆菌DNA疫苗的免疫原性,构建具有靶向作用于APC细胞的核酸疫苗.方法:利用基因工程技术,将靶向基因片段和过氧化氢酶基因融合构建了核酸疫苗.体外转染293T细胞,间接免疫荧光和ELISA检测其基因表达情况.用该核酸疫苗肌肉免疫注射BALB/c小鼠后,测定其血清IgG、IgG1和IgG2a水平.结果:间接免疫荧光检测转染DNA疫苗的293T细胞,表明该疫苗能在真核细胞中表达目的抗原,通过ELISA方法测定表明其仍具有IgG抗体结合能力.BALB/c小鼠免疫后血清测定结果表明,该靶向核酸疫苗诱导的抗体水平高于对照质粒pDNAkat,抗体分型实验显示靶向核酸疫苗pcDNAkathIgz和pcDNAkat,促进了免疫反应类型由Th2向Th1的部分偏转.结论:成功构建了靶向APC细胞的幽门螺杆菌核酸疫苗,并在小鼠体内诱导了较高的抗体水平. 相似文献
33.
34.
目的 观察TGFβ1正、反义基因转染6 0 Coγ射线照射的HELF后对其TGFβ1mRNA及Ⅰ型前胶原mRNA表达调控的影响。方法 采用脂质体介导法进行基因稳定转染 ,转染细胞经PCR ,DNAdotblot鉴定和RNAdotblot分析。结果 选择 5Gy照射细胞 ,采用LipofectAMINE将TGFβ1正、反义基因表达载体pMAMneo TGFβ1和pMAMneo AntiTGFβ1转入HELF ,转染细胞经G418抗性筛选出来 ,并且在糖皮质激素地塞米松诱导下培养。提取培养细胞的RNA和染色体DNA ,转染细胞DNA与地高辛标记的neo特异探针杂交阳性 ,且可用neo基因特异的PCR引物扩增出 2 76bp的阳性片段。对提取的RNA用地高辛标记的TGFβ1探针和α1(Ⅰ )寡核苷酸探针经RNAdotblot分析表明 ,转染pMAMneo AntiTGFβ1的细胞其TGFβ1mRNA水平下降 ,而转染pMAMneo TGFβ1的细胞其TGFβ1mRNA水平则升高。对于Ⅰ型前胶原mRNA ,前者表达水平比未转染细胞低 ,后者则略高。 结论 TGFβ1反义基因转染6 0 Coγ射线照射的人胚肺成纤维细胞后可以使细胞中TGFβ1mRNA含量水平减少 ,使Ⅰ型前胶原mRNA表达水平降低 相似文献
35.
目的:结一株临床分离的高粘附力幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)菌株进行会素基因hpaA的序列分析,为研究Hp的粘附提供分子基因。方法;设计hpaA的特异引物,交去物插入pUC19载体要建hpaA的重组克隆,DNA自动分析仪进行序列测定,ClustalX和Homology软件分析DNA及其推导出的基酸序列。结果:构建了粘附素HpaA的重组质粒pUChpa,测充显示hpaA结 相似文献
36.
38.
目的通过基因工程技术制备幽门螺杆菌(Hp)保守区(AB)蛋白,并在体外探讨其安全性、免疫原性和黏附作用,以确定AB在卸疫苗研制中的应用价值.方法运用PCR技术从Hp总DNA中扩增出AB结构基因.装入pET-22b(+)载体进行序列及生物信息学分析,并在大肠杆菌BL21(DE3)中表达,采用金属螯合亲和层析(MCAC)的方法纯化AB,免疫印迹法检测其抗原性;流式细胞术检测AB致T细胞表达FasL的作用,ELISA法测定Hp感染者血清中抗AB抗体,MTT法测定T细胞对AB的增殖反应,光镜计数法研究AB抗体对Hp与胃癌细胞粘附的影响.结果成功构建了AB的重组质粒pET-22b(+)/AB,序列分析显示获得了段588 bp的基因,完整的包含了粘附素C-端的7个保守区,Parker法和Welling法分析显示AB具有良好的抗原性。进一步应用INTERNETExPASY、NNPREDICT、ISREC等生物信息软件分析,发现其为膜孔素样结构,是跨膜区膜外区域的重要表位组成部分。在Genebank中BLAST分析了836767个蛋白序列,与其具有同源性者均为厅声外膜蛋白序列。蛋白电泳分析和凝胶扫描表明获得了高效表达AB的克隆株,其分子量为22.5kD,占菌体总蛋白的29.6%,其中可溶性表达占上清的21.9%,纯化后获得纯度达90%的重组蛋白AB,免疫印迹显示该蛋白可被AlpA兔抗血清抗体识别;体外安全性实验表明AB无明显调节T细胞表达FasL的作用;ELISA法共检测了55份血清,同时以RUT作为平行对照,两法的评价判断一致性程度的指标卡帕系数为0.76.同时,低剂量AB即可刺激Hp+PBL的增殖:AB抗血清能部分阻断Hp与胃癌细胞系的粘附,在光镜下表现为经抗AB兔血清预处理后,每细胞周围粘附的细菌数较免疫前兔血清预处理组显著减少(p<0.05).结论获得HeAB的基因工程蛋白产物,为Hp疫苗研制提供了一种新抗原,生物信息学分析显示其为良好的抗原成分;体外实验证实AB是安全的、具有免疫原性的Hp菌体成分,既可以刺激体液免疫,又能够提高细胞免疫,并已其抗体还可防止Hp与胃上皮细胞的粘附。 相似文献
39.
40.
定居因子是产肠毒素大肠杆菌(ETEC)的主要毒力因子之一。它在ETEC对肠粘膜上皮细胞的粘附过程中起着重要的介导作用。在已知的定居因子中,CFA/Ⅱ为优势血清型定居因子抗原之一,它由CS1、CS2和CS3三种组分所构成。其中CS3组分为CFA/Ⅱ阳性菌的共有抗原。本工作运用DNA体外重组方法克隆了CS3基因,并对其结构进行了分析。 相似文献