实验树鼩空肠弯曲菌、沙门氏菌和志贺菌多重荧光定量PCR方法的建立

目的为实验树鼩微生物检测提供一种快速、简便、灵敏,并且特异性强的空肠弯曲菌、沙门氏菌和志贺菌多重荧光定量PCR检测方法。方法根据空肠弯曲菌的Hip O区域、沙门菌的in V区域和志贺菌的ipa H区域设计特异性引物和探针,并进行单病原定量PCR检测验证;后分析多重PCR的灵敏度和特异性,并使用该多重PCR方法检测实验树鼩样品。结果本研究的PCR要素可用于空肠弯曲菌、沙门氏菌及志贺菌等单种菌的实时荧光定量PCR扩增。多重定量PCR扩增出了空肠弯曲菌、沙门氏菌和志贺氏菌标准扩增曲线;该方法的灵敏度为1×103ng/μL;特异性检测未从其他参考菌株中检出阳性。结论该多重定量PCR方法在实验树鼩微生物检测中具有很好的应用和推广前景。     

实验小鼠肾匀浆中酯酶-3的实验室测定能力验证结果评价

[摘要] 目的 通过实验小鼠肾匀浆中酯酶-3项目的检测比对,了解全国实验动物质量检测实验室的水平,促进各实验室加强质控。方法 按照CNAS批准的能力验证方案,制备样品并将稳定性和均匀性合格的样品作为能力验证样品,进行随机编号,随作业指导书一起发放给参加单位。在规定时限提交检验报告和原始记录复印件,其结果与样品预检结果完全一致的判为优秀结果;除杂合型判定以外的结果均一致的判定为满意结果,否则判为不满意结果。结果 共10个实验室报名参加本次比对试验,其中优秀结果0个实验室;满意结果的有9个实验室,占参加比对实验室的90.0%;不满意结果1个实验室,占参加比对实验室的10.0%。结论 本次能力验证项目反映了各参与实验室在实验小鼠肾匀浆中酯酶-3的总体检测能力较高,但检测细节及部分实验室技术水平还有待提高。     

肝螺杆菌多重PCR检测方法的建立及应用

目的建立肝螺杆菌的多重PCR检测方法,对中国动物肝螺杆菌进行检测。方法以毒力基因flaB基因、ureA基因和cdtB基因和cdtC基因作为靶基因,建立检测肝螺杆菌的多重PCR方法。对肝螺杆菌、空肠弯曲菌、幽门螺杆菌、沙门氏菌、志贺氏菌、小肠结肠炎耶尔森菌、大肠埃希氏菌和铜绿假单胞杆菌抽提的DNA进行多重PCR扩增。应用本研究建立的多重PCR检测方法对482只动物(其中:海南30只猴、江苏34只小鼠和北京32只猴、30头猪、66只犬、13只兔、29只豚鼠、69只大鼠、213只小鼠)进行检测,对扩增出的阳性结果进行测序。同时,对所有样本采用选择性培养基进行肝螺杆菌培养以作对照。结果肝螺杆菌能扩增出各自的特异性条带,而其他参考菌株均未扩增出条带,这表明该方法具有较强的特异性。482份样本中检出43份肝螺杆菌阳性样本,阳性率8.92%(43/482),其中:2只犬(3.03%,2/66)、1只兔(7.69%,1/13)、5只大鼠(7.25%,5/69)和35只小鼠(16.43%,35/247)均扩增出肝螺杆菌毒力基因片段。结果显示,肝螺杆菌flaB基因、ureA基因和cdtB基因和cdtC基因序列与GenBank中的肝螺杆菌ATCC51449的相应基因序列核苷酸同源性高达99%。用选择性培养基能培养出肝螺杆菌。结论中国动物中的犬、兔、大鼠和小鼠均能检出肝螺杆菌flaB基因、ureA基因、cdtB基因和cdtC基因。建立的多重PCR检测方法可作为肝螺杆菌大规模检测的新技术,这为在中国开展肝螺杆菌流行病学调查提供了有效科学工具。     

微卫星技术在NIH小鼠群体遗传结构分析中的应用

目的应用微卫星DNA技术对A单位NIH小鼠和B单位NIH小鼠的遗传结构进行对比分析。方法利用30个微卫星位点对2个NIH小鼠种群进行PCR扩增和STR扫描,借助统计软件Popgene 1.32进行群体遗传结构分析。结果 A单位NIH群体获得74个等位基因型,平均杂合度为0.3108,多态性信息含量为0.2637;B单位NIH群体获得76个等位基因型,平均杂合度为0.3257,多态性信息含量为0.2777。群体间比较显示,群体间分化系数为0.3932,遗传一致性指数0.3971,遗传距离为0.9235,群体差异显著。结论两个NIH小鼠群体间存在严重的遗传分化,形成了两个不同的封闭群群体。     

实验小鼠血清中酯酶-1的检测能力验证结果评价

目的通过实验小鼠血清中酯酶-1项目的检测比对,促进全国实验动物质量检测实验室加强质控管理,提升检测能力。方法按标准程序制备能力验证样品,随机编号,冷链运输发放给参加单位。参与者在规定时限提交检验结果和原始记录复印件。所得结果与样品预检结果完全一致的判为满意结果,否则为不满意结果。结果共11个实验室报名参加本次比对试验,其中满意结果的有10个实验室,占参加比对实验室的90.9%;不满意结果 1个实验室,占参加比对实验室的9.1%。结论本次能力验证项目反映出各参与实验室在实验小鼠肾匀浆中酯酶-1的总体检测水平较高,但仍需注重标准规范和检测细节。     

两个封闭群NIH小鼠群体的遗传监测结果的比较分析

摘要 目的：对近3年北京地区的两个NIH封闭群小鼠群体的遗传质量进行监测分析。 方法：利用生化标记基因检测法,2011年测定A、B两单位NIH小鼠在碱性磷酸酶-1等14个遗传生化标记位点上的多态性。2014年利用相同方法原则对B单位的NIH小鼠群体进行抽样检测,比较了该小鼠群体3年来的遗传构成变化。结果：2011年,A、B两单位NIH小鼠群体均呈多态性的生化标记位点有6个（Ce2、Car2、Gpi1、Es10、Gpd1、Pgm1）,且B单位在Es3位点也呈多态性;两群NIH小鼠在Car2位点有差异（P<0.05）,在Es3、Gpd1、Pgm1三个位点有显著差异（P<0.01）;两群体的群间分化系数为0.0406,遗传一致性指数为0.9619,遗传距离为0.0388。与2011年相比,B单位封闭群NIH小鼠在2014年出现了2个纯合位点（Ce2和Gpd1）,同时Es10和Gpd1两位点差异极显著（P<0.01）,Pgm1位点差异显著（P<0.05）;不同代次NIH小鼠群间分化系数为0.1103,遗传一致性指数为0.8847,遗传距离为0.1266。结论：群体隔离、选种育种、种群数量和繁育代次等对NIH小鼠遗传构成差异影响显著。留种和繁育生产时应加强封闭群NIH小鼠的遗传监测,为其遗传质量的稳定性提供保障。     

国家上海KM小鼠种子群体遗传状况分析

目的 对国家啮齿类实验动物种子中心上海分中心KM小鼠种子群体进行群体遗传质量分析与评价。方法 利用筛选出的30个微卫星位点设计引物,对种群中随机抽取的30只KM小鼠样本进行PCR扩增,扩增产物利用STR扫描技术进行测定,用Popgen1.32软件对所得结果进行处理分析。结果 KM小鼠种子群体共得到123个等位基因型,平均有效等位基因数为2.3989,平均杂合度为0.5342,平均多态性信息含量(PIC)为0.4735。结论 上海分中心KM小鼠种子群体具有良好的遗传稳定性和多样性,符合封闭群动物的群体遗传概貌特征。     

CAR菌TaqMan MGB探针法实时荧光定量PCR快速检测方法的建立与应用研究

目的 建立特异、敏感、快速检测CAR菌的TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法。方法 针对CAR菌16S rRNA基因序列设计特异性引物和探针,建立MGB探针荧光定量PCR方法,验证方法的特异性、敏感性和稳定性。对2008~2012年期间采集的1344份临床标本中的CAR菌进行检测,同时进行普通PCR检测作为对照。结果 CAR菌TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有高度特异性,与肺炎支原体、侵肺巴斯德菌、支气管鲍特杆菌、肺炎克雷伯杆菌、大肠埃希氏菌、肺炎链球菌间无交叉反应,检测灵敏度达2.7拷贝。标准曲线显示各浓度范围内具有良好线性关系,相关系数为0.999,斜率为-3.22,TaqMan MGB探针荧光定量PCR效率为104.432%。对1344份标本进行检测,结果TaqMan MGB探针荧光定量PCR检出510份CAR菌阳性样本。TaqMan MGB探针荧光定量PCR能够直接从标本中检出CAR菌DNA,检测时间仅为40分钟。结论 TaqMan MGB探针荧光定量PCR方法具有可靠、特异、敏感的特点,适用于CAR菌的快速检测。     

鼠诺如病毒的体外分离与鉴定

目的体外分离出小鼠诺如病毒(murine norovirus,MNV)毒株,并对其进行鉴定。方法采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法对小鼠进行MNV筛查,将检测出的MNV阳性小鼠的盲肠内容物经过处理接种至鼠源巨噬细胞系RAW264.7细胞,培养一段时间后用RT-PCR法扩增测序。结果成功通过传代RAW264.7细胞分离出MNV,并经过鉴定确认,对RT-PCR扩增序列进行初步分析,与韩国MNV4 S18株同源性最高,达99%。结论 MNV在体外的复制成功,为MNV的生物学特性、致病机制和诊断试剂等方面的研究提供了基础,同时作为人诺如病毒研究的理想模型,对人诺如病毒的研究也有重大意义。     

首次从中国小鼠中分离到肝螺杆菌及其鉴定

目的对中国小鼠肝螺杆菌进行分离鉴定。方法采集中国某实验动物中心发病小鼠标本,采用细菌学分离培养、血清学试验、多重PCR检测、病理组织学检查等方法进行鉴定,并对细菌的分子生物学特征进行分析。结果分离到一株能产生多种毒素的细菌,经鉴定为肝螺杆菌(HHm0801)。用螺杆菌属16SrRNA基因特异引物和肝螺杆菌16SrRNA基因、flaA基因、flaB基因、ureA基因、cdtB基因、cdtC基因特异引物对HHm0801细菌的PCR扩增为阳性,经核苷酸序列测定分析证实上述序列与肝螺杆菌ATCC51449基因序列(GenBank登录号:NC004917)同源性高达99%。肝螺杆菌感染小鼠肝脏的肝细胞肿大,出现大小不等的空泡,部分胞核深染,局部坏死,肝小叶脂肪变性;直肠部分绒毛脱落,有少量炎性细胞,局部充血。脾脏淋巴细胞散在分布,小叶间隔不清晰,脾巨噬细胞增多。眼睛巩膜增厚,晶状体部可见深色物质沉着。结论首次从中国小鼠中分离到了肝螺杆菌,为进一步研究该菌及开展流行病学调查提供了科学依据。