PspA免疫小鼠抗肺炎链球菌侵袭性感染研究

目的:获取原核表达的肺炎链球菌PspA重组蛋白并研究其作为疫苗的价值. 方法:分离培养肺炎链球菌TIGR4,获取其染色体DNA,采用基因体外重组法将编码PspA抗原表位在内的部分序列克隆到原核表达载体PET-32(a)内,酶切及测序鉴定重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导,将获得的重组蛋白用Western Blot鉴定,镍柱纯化并透析除盐. 用重组蛋白免疫动物,观察PspA抗体对肺炎链球菌感染小鼠的保护作用. 结果:DNA序列与GenBank中的数据相符,所表达纯化的蛋白经Western Blot证实为PspA,其抗体在肺炎链球菌感染中对小鼠有保护作用. 结论:重组PspA刺激产生的抗体能够有效抵抗肺炎链球菌TIGR4侵袭性感染,该重组蛋白可作为肺炎链球菌多肽联合疫苗的组成部分之一.     

基因芯片在感染性疾病研究中的应用

人类基因组计划、病原体基因组测序的完成,以及基因芯片技术的出现,为研究感染性疾病的致病分子开拓了新的天地。基因芯片技术因具有检测快速、高效、并行等特点,加速了对微生物和宿主之间复杂的遗传学过程的认识,有利于发现病原体毒力相关基因和宿主防御策略,从而有助于感染性疾病的诊断、治疗和预防。     

自身淬灭探针荧光定量PCR检测淋病奈瑟菌

目的利用自身淬灭探针技术建立敏感、特异、快速、价廉且能广泛应用的淋病奈瑟菌荧光定量PCR检测方法。方法构建重组质粒pGEM-11Zf-CPPB作为标准品,自行设计自身淬灭探针,建立、优化定量PCR体系,并进行方法学评价及临床应用。结果所建立方法的线性检测范围为101～109拷贝/μL,灵敏度为10拷贝/μL,特异性为100%。天间变异系数(CV)为2.38%,批内CV为1.32%,批间CV为2.75%。该方法比培养方法更快速、灵敏。结论以自身淬灭探针技术为平台的淋病奈瑟菌荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性好,对淋病的早期快速诊断有较高价值。     

颗粒蛋白前体通过CTLA4调控调节性T细胞的发育和功能

目的探讨颗粒蛋白前体(PGRN)对调节性T细胞发育和功能的影响及分子机制。方法在野生型和PGRN敲除小鼠模型中,采用流式细胞术检测小鼠中枢及外周各淋巴器官中T细胞各亚群的比例及调节性T细胞比例及其功能相关分子的表达;采用RT-PCR检测调节性T细胞中CTLA4的表达;最后采用调节性T细胞体外抑制试验验证其功能变化。结果与野生型小鼠相比,PGRN敲除小鼠脾脏、胸腺和淋巴结中调节性T细胞的比例均升高,特别发现在脾脏调节性T细胞中CTLA4在基因和蛋白表达水平均显著升高。体外功能试验发现PGRN敲除小鼠的脾脏调节性T细胞的抑制功能也较野生型增强。结论 PGRN在调节性T细胞的发育和功能中扮演重要角色,其机制可能涉及CTLA4。     

用融合蛋白在大肠杆菌中高表达百日咳杆菌毒素蛋白S＿3亚基基因

用多聚酶链反应（ＰＣＲ）和基因重组技术通过百日咳毒素Ｓ＿３亚基基因和高表达质粒ｐＭＡＬ－Ｃ构建了麦芽糖结合蛋白（ＭＢＰ）和（Ｓ＿３）亚基蛋白的融合基因，并在大肠杆菌中高效表达了（ＭＢＰ－Ｓ＿３）融合蛋白。该融合蛋白产率占细胞总蛋白含量的２５％，并且能用蛋白酶因子Ｘａ将融会蛋白切开，得到ＭＢＰ（４２ＫＤ）和Ｓ＿３亚基蛋白（２１．８７ＫＤ）．该方法表达式效率高。纯化过程简单，为基因工程技术生产该毒素提供了新的途径。     

体液端粒酶检测在恶性肿瘤诊断中的应用进展

体液端粒酶活性检测因其标本来源方便、创伤性小已成为当令肿瘤分子生物学研究的一个新的靶点。本文对端粒酶活性的检测方法及各种体液标本包括腹水/胸腔积液、支气管冲洗/灌洗液、尿液/膀胱冲洗液、血浆/血清端粒酶活性检测对恶性肿瘤的诊断价值进行了综述。     

肺炎链球菌MarR家族蛋白SPD_0379通过调节基因rafX的表达调控磷壁酸的合成

目的：明确肺炎链球菌MarR家族蛋白SPD_0379对细菌磷壁酸（teichoic acids,TA）的调控作用。方法：通过凝胶阻滞实验验证SPD_0379蛋白与rafX基因启动子序列的结合,通过LacZ报告基因观察细菌在spd_0379基因缺陷后的rafX基因表达变化,通过斑点杂交、ELISA和流式细胞术检测细菌磷壁酸的含量变化,通过生长曲线分析揭示SPD_0379蛋白在细菌生长中的作用。结果：SPD_0379蛋白与rafX基因启动子序列发生特异性结合,spd_0379基因缺陷后,细菌的rafX基因表达上调（t=10.010,P=0.001）,免疫斑点与ELISA均显示磷壁酸含量明显升高（t=5.848,P=0.004;t=4.653,P=0.001）,且缺陷菌的自溶较野生菌明显提前。结论：SPD_0379蛋白负调控rafX基因的表达,抑制细菌磷壁酸的合成,参与细菌自溶的调控。     

体内表达细菌毒力基因分析

面对复杂的宿主环境，细菌在体内是通过调节表达不同的毒力基因建立并延续其感染过程的。目前已建立起多种方法去分析鉴定体内特异表达的细菌毒力基因。其中体内表达技术的应用力为鉴定细菌毒力基因以及揭示细菌致病机理开辟了有力的途径。本文对此作一综述。     

IL-27诱导人成纤维样滑膜细胞产生IL-6的免疫机制

目的：探讨白介素-27（interleukin-27,IL-27）对人成纤维样滑膜细胞（fibroblast-like synoviocyte,FLS）的体外活化效应及细胞内信号传导机制。方法：IL-27处理FLS后,酶联免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay,ELISA）检测细胞培养上清液中白介素-6（interleukin-6,IL-6）水平的变化;信号通路抑制剂处理FLS后1 h,用IL-27刺激FLS 48 h,ELISA检测细胞上清液中IL-6的水平变化;Western blot检测IL-27刺激FLS不同时间细胞内信号通路蛋白的磷酸化水平。结果：IL-27能刺激正常关节来源的FLS（N-FLS）和RA患者关节来源的FLS(RA-FLS)产生IL-6,IL-27（50 ng/mL）刺激N-FLS产生的IL-6水平[（1329.10±113.15） pg/mL]和刺激RA-FLS产生的IL-6水平[（1 583.70±129.54） pg/mL]较其阴性对照明显升高（P=0.001,P=0.001）。用不同浓度（0、10、20、50、100 ng/mL）IL-27分别处理2种细胞不同时间（0、12、24、48 h）,产生IL-6的水平随浓度和时间增加而升高,具有时间和剂量依赖性。JAK抑制剂AG490和JNK抑制剂SP600125可显著抑制IL-27诱导N-FLS和RA-FLS产生IL-6。IL-27刺激N-FLS和RA-FLS后,细胞内信号通路蛋白JAK2和JNK的磷酸化水平明显升高（JAK2：F=303.000,P=0.000;F=640.400,P=0.000;JNK：F=98.840,P=0.000;F=54.820,P=0.001）。结论：IL-27可通过激活FLS细胞内JAK2和JNK信号通路上调FLS产生IL-6水平,从而增强关节滑膜的炎症反应。     

干化学法建立重庆地区健康儿童肝功能指标参考区间值的横断面调查

目的 通过干化学法建立重庆地区3月龄至18岁健康儿童适合年龄和性别的8项肝功能指标参考值。方法选择3月龄至18岁健康儿童,根据年龄分为5组。采用美国强生公司VITROS 5600干化学分析仪检测8项肝功能指标:血清总胆红素(TB)、总蛋白(TP)、清蛋白(ALB)、丙氨酸转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、碱性磷酸酶(ALP)、γ谷氨酰转肽酶(GGT)和乳酸脱氢酶(LDH),比较不同年龄和性别各项肝功能指标的差异,采用非参数方法计算参考区间。结果 研究期间3 758名3月龄至18岁健康儿童符合纳入和排除标准,剔除35份不合格标本,3 723份合格标本纳入分析。3月龄至1岁组241份,～3岁组251份,～6岁组939份,～12岁组1 672份,～18岁组620份。①～3岁组TP和ALT,～6岁组TP和AST,～12岁组TB、ALT、AST、GGT和LDH,～18岁组TB、ALB、ALT、AST、ALP、GGT和LDH检测结果均为男高于女,差异有统计学意义(P均<0.05)。②ALT、AST和LDH检测结果与年龄呈负相关,TB、TP、ALB、ALP和GGT检测结果与年龄呈正相关。③8项肝功能指标参考区间为TB(μmol·L^-1):3月龄至1岁组1.0~11.0,～18岁组1.0~16.3;TP(g·L^-1):3月龄至3岁组60.2~74.2,～6岁组61.3~78.2,～12岁组62.8~81.5,～18岁组64.9~82.4;ALB:3月龄至18岁组38.4~49.5 g·L^-1;ALT(U·L^-1):3月龄至1岁组15.8~48.4,～12岁组14.0~42.2,～18岁组男14.7~45.7、女12.5~44.8;AST(U·L^-1):3月龄至1岁组23.9~54.3,～3岁组26.4~50.6,～6岁组22.8~45.8,～12岁组18.9~41.2,～18岁组男15.7~36.8、女14.2~33.7;ALP(U·L^-1):3月龄至12岁130.0~318.5,～18岁组男124.2~416.1、女79.9~320.3;GGT(U·L^-1):3月龄至1岁组10.0~30.0,～12岁组9.3~21.3,～18岁组男9.6~28.7、女9.5~26.2;LDH(g·L^-1):3月龄至3岁组165.9~266.0,～6岁组155.3~256.2,～12岁组142.9~240.9,～18岁组男134.3~225.3、女111.3~207.0。结论 重庆地区3月龄至18岁健康儿童不同年龄和性别的肝功能水平存在差异,干化学法建立适应年龄和性别的肝功能指标参考区间对相关疾病的诊疗有重要意义。