宏基因组学与道地药材研究

宏基因组学是将分子生物学技术应用于微生物基因总和研究的一门新兴学科,现已广泛应用于医药、农业、海洋生态环境、土壤生态环境等领域。道地药材凭借其质优、疗效好的优势自古以来被各医家所青睐,其形成与诸多因素有关,其中根际微环境在药用植物次生代谢产物形成中起着重要作用。着重介绍宏基因组学的概念、技术策略以及其在道地药材研究中的应用现状,进一步阐明土壤微生物对道地药材形成机制的影响,并为解决药用植物连作障碍提出新的研究思路。     

应用DNA条形码技术鉴定中药材灯心草

目的:应用植物类药材通用条形码ITS2鉴定中药材灯心草。方法:对灯心草药材及其密切相关种进行PCR扩增和测序,运用CodonCode Aligner对所获ITS2序列进行拼接。应用MEGA5.0软件计算Kimura 2-parameter(K2P)遗传距离。采用相似性搜索法、最近距离法、PWG距离法及构建NJ(邻接)系统聚类树等方法进行鉴定分析。结果:灯心草药材种内K2P遗传距离在0～0.005,远远小于灯心草与其他密切相关种之间的K2P遗传距离(0.215～0.614);4种鉴定方法均表明ITS2序列可以有效区分灯心草与其密切相关种。结论:植物类药材通用条形码ITS2适用于鉴定中药材灯心草,进一步证明了ITS2对中药材的鉴定能力。     

道地药材产地溯源研究

道地药材极具中医药特色,是公认的品质优良的药材。古籍的记载及现代研究均认为,产地是道地药材形成的一个重要原因。由于道地药材盲目引种导致的质量下降,生产及销售等环节可能存在的伪劣药材,增加了中药材安全事故发生的风险。中药材安全事故频发不仅影响了中药材市场出口海外,更威胁到中医临床用药的安全性。因此迫切需要建立中药材可溯源系统,提供便捷的药材流通环节信息记录以及追溯功能。该文综述了道地药材可溯源的多种技术方法,并提出基于二维码及网络数据库建立道地药材溯源系统的实现方法。     

罗汉果脱毒苗的快速繁殖研究

目的筛选适宜的罗汉果脱毒苗茎段增殖培养基,研究培养温度与光照对茎段增殖培养的影响。方法采用正交试验设计和完全随机实验设计筛选罗汉果脱毒苗茎段增殖培养基。正交L9(34)实验以在M S BA 0.1 m g/L NAA 0.1 m g/L上培养30 d的罗汉果脱毒苗单芽姊妹系的单节茎段为外植体,以培养基中BA,NAA,IBA及蔗糖为试验因子,各因子设3个水平,以在不同处理得到的增殖系数为测定指标;在此基础上进一步研究了培养基中BA和蔗糖质量浓度对增殖效果的影响;采用完全随机实验设计研究温度,光照对茎段增殖培养生成试管苗的影响。结果通过对正交实验结果的极差分析及方差分析表明,在4个因子中,对罗汉果茎段增殖系数影响最大的是BA,其次是蔗糖的NAA,IBA的影响最小;BA,NAA,IBA及蔗糖对增殖系数的影响都达到极显著。根据新复极差检验的结果,当前研究得到的罗汉果离体茎段的最佳增殖培养基为M S BA 0.5 m g/L NAA 0.01 m g/L IBA 0.1 m g/L 蔗糖40 g/L,罗汉果茎段在此培养基上培养30 d后增殖系数为13.13;不同浓度BA与蔗糖对茎段培养的研究结果表明,BA在1.0 m g/L增殖系数最大。考虑为保持试管苗的遗传稳定性,BA为0.5 m g/L为宜。增殖培养基中的蔗糖适宜质量浓度为4.0%;罗汉果茎段培养适宜条件为培养温度25℃,培养光强1 000~3 000lx。结论增殖培养基的成功筛选及培养温度与光强的选择,有助于实现罗汉果脱毒苗的工厂化生产。     

中药材蜈蚣及其混伪品DNA条形码鉴别研究

利用DNA条形码技术对蜈蚣药材进行鉴别,为蜈蚣药材鉴定提供新的方法。该研究以COI条形码序列为基础,对蜈蚣实验样品进行DNA提取,PCR扩增和双向测序,用MEGA6.0软件对所有5个物种的50份样品进行序列比对和邻接（NJ）树构建。结果显示实验样品均可以获得COI序列,蜈蚣药材与其混伪品COI序列种间平均K2P距离为0.222,种间最小K2P 距离为0.190,基于COI序列构建的邻接（NJ）树中少棘巨蜈蚣单独聚在一枝,与其混伪品可以相互区分。因此基于COI条形码序列可以准确鉴定蜈蚣及其混伪品。     

鳖甲及其混伪品的DNA分子鉴定

目的:探讨快速、准确鉴定鳖甲及其混伪品的方法.方法:本文对中华鳖及其混伪品的COI序列用MEGA 4.0等软件进行遗传距离等分析,并构建中华鳖及其混伪品的NJ树.结果:中华鳖种内COI序列变异很小,种间存在较多的变异位点,种间的遗传距离显著大于种内的遗传距离.由所构建的系统聚类树图可以看出,同属聚在一起,且各物种又形成相对独立的支.结论:基于COI序列的DNA条形码技术可以很好地鉴定鳖甲及其混伪品.     

基于ITS2序列的羌活及其混伪品的DNA条形码鉴定

目的对羌活及其混伪品进行分子鉴定,以确保该药材的质量以及临床疗效。方法利用PCR测序法,对样品进行核基因ITS2片段扩增并双向测序,所得序列经CodonCode Aligner拼接后,用软件MEGA4.0进行相关数据分析,并构建邻接(NJ)树。利用已建立的ITS2数据库及其网站预测ITS2二级结构。结果羌活与宽叶羌活ITS2序列长度均为228 bp,二者种内平均K2P(Kimura-2-parameter)遗传距离均远远小于其与混伪品的种间平均K2P遗传距离;由所构建的系统聚类树图可以看出,羌活与宽叶羌活均表现出了单系性,而同时又与其他混伪品明显分开;比较ITS2二级结构发现,羌活基原植物与其混伪品在4个螺旋区的茎环数目、大小、位置以及螺旋发出时的角度均有明显差异。结论 ITS2序列作为DNA条形码可以方便快捷地鉴别羌活及其混伪品,为其种质资源鉴定及临床安全用药提供了重要分子依据。     

应用ITS2条形码鉴定中药材合欢皮、合欢花及其混伪品

为准确鉴别中药材合欢皮、合欢花及其混伪品,该研究应用ITS2条形码对46份药材及其混伪品进行鉴定研究。通过对样本进行基因组DNA提取,PCR扩增和双向测序获得ITS2序列。所得序列经CodonCode Aligner 拼接后,基于隐马尔可夫模型的HMMer 注释方法去除两端5.8S 和28S 区段,用软件MEGA5.0对序列进行分析比对,并基于K2P模型进行遗传距离分析。采用相似性搜索法、最近距离法、构建NJ树对序列鉴定能力进行评估。结果表明,药材基原物种合欢的ITS2序列种内最大K2P遗传距离均远小于其与混伪品的种间最小K2P遗传距离;应用相似性搜索法分析结果表明ITS2 序列可准确鉴定合欢药材及其混伪品;NJ树显示合欢药材与其混伪品可明显区分开,表现出良好的单系性。因此,应用ITS2条形码可稳定、准确地鉴别合欢药材及其混伪品。     

龙骨马尾杉PcHDR1基因克隆及序列分析

该研究采用RT-PCR方法对龙骨马尾杉Phlegmarirus carinatus(Desv.)Ching 1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-焦磷酸还原酶[1-hydroxy-2-methyl-2-(E)-butenyl 4-diphosphate reductase,HDR]基因Pc HDR1的编码区进行克隆并利用生物信息学方法进行序列分析。根据实验室已获得的龙骨马尾杉转录组数据,从中获得1条编码HDR的转录本,采用RT-PCR方法获得该基因的全长c DNA序列,所克隆的Pc HDR1基因编码区长为1 437 bp,编码478个氨基酸残基,Gen Bank登录号为JQ957845。Pc HDR1与银杏Ginkgo biloba的HDR序列同源性最高,达78%。生物信息学预测Pc HDR1蛋白没有跨膜区,具有Lyt B保守结构域,不含信号肽。该研究克隆并获得了龙骨马尾杉Pc HDR1基因的编码区序列,并对其编码的蛋白进行了序列分析及结构域预测,为进一步研究HDR的功能奠定基础。     

基于ITS2 序列的女贞子原植物及其混伪品的分子鉴定

目的:通过分析女贞子原植物及其混用品和伪品的ITS2序列,探究鉴定女贞及其混伪品的新方法。方法:采用CodonCode Aligner进行序列拼接,MEGA4.1计算女贞及其混伪品的种内、种间的K2P距离,并基于K2P模型构建NJ树,最后应用Schultz等建立的ITS2数据库和网站预测二级结构。结果:女贞的最小种间K2P距离(3.2%)大于种内最大K2P距离(0.90%),NJ树中女贞的不同来源样品聚为一支。女贞与其混伪品的二级结构的分子形态均有差异。结论I:TS2序列可以作为鉴定女贞子原植物及其混伪品的条形码序列,并且该序列在中药材原植物的鉴定中具有很大的潜力。