大鼠Akt1基因真核表达载体构建及其在293细胞中的表达

背景: Akt在细胞存活、细胞增殖、细胞代谢和细胞凋亡等活动中扮演着重要角色。虽然Akt的作用机制目前尚有很多的未知领域,但其作为生存信号的一个重要组件,已成为近年分子生物研究中的一个重要课题。 目的：构建Akt1基因真核表达载体 pDC316-Akt1,观察其在293细胞(人胚肾母细胞)中的表达。 设计、时间及地点：观察性实验,于2006-09/12在解放军军事医学科学院分子生物实验室完成。 材料：pDC316质粒,由本元正阳公司提供;DH5α、293细胞为自备。 方法：采用反转录-聚合酶链反应方法自大鼠肝组织总RNA中克隆Akt1DNA片段,测序鉴定正确后,插入真核表达载体pDC316的EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ的酶切位点,构建Akt1真核表达载体 Akt-pDC316,脂质体介导法转染293细胞。 主要观察指标：蛋白免疫印迹检测转染293细胞中Akt1的表达。 结果：经测序鉴定,构建的Akt1氨基酸序列与野生型Akt1序列完全相符。将Akt-pDC316转入293细胞,蛋白免疫印迹检测可见相对分子质量55 000位置有Akt1的表达。 结论：构建Akt1基因真核表达载体在293细胞中可以充分的表达。     

胰岛分离与纯化的实验研究

目的　通过改进胰岛的制备方法 ,以提高胰岛的获取数量和质量 ,从而解决可供移植的有功能的胰岛数量不足这一矛盾。方法　在经典的胰岛制备方法基础上对其加以改进 ,即在胶原酶V分离液及Fio11-40 0纯化液中加入STI与BSA -FractionV后 ,进行胰岛的分离与纯化。结果　胰岛的产量为 (1,36 0± 2 75 )EIN/胰腺 (n =8) ,纯度为 85 % ,存活率为 90 % ,胰岛的生物学活性良好。结论　改良的胰岛制备方法可大幅度提高胰岛的获取数量和质量     

上消化道恶性肿瘤中p16基因突变的研究

目的　研究p16基因突变与食管癌和胃癌发生的关系。方法　采用PCR、多重PCR、PCR SSCP和DNA测序等技术分析了 2 5例食管癌和 40例胃癌组织标本。结果　 1.食管癌中p16基因突变频率为 16 % ,并且突变频率与肿瘤的大小、位置、分化程度和有无淋巴结转移无关 (P >0 .0 5 )。 2 .胃癌中p16基因突变频率为 7.5 % ,并且突变与肿瘤的大小、位置、分化程度和有无淋巴结转移无关 (P >0 .0 5 )。结论　 1.P16基因点突变可能是食管癌和胃癌发生发展过程中的影响因素之一 ,错义突变是其失活的主要原因。 2 .P16基因点突变的检测对食管癌和胃癌早期诊断有一定帮助。     

丹参对大鼠胰岛获取和冻存及体外培养影响的实验研究

胰岛移植是治疗I型糖尿病较理想方法，移植成功的关键是胰岛足够数量和良好功能。细胞冻存是收集足够胰岛、建立胰岛库的可行手段。但冻存复苏过程可引起细胞的破坏和死亡，使细胞数量减少、活性及功能降低。本实验探讨丹参能否有益于胰岛获取及冻存前后的存活和功能，及其作用的可能机制。     

造血干细胞基因治疗甲状旁腺功能低下症的实验研究

临床上对各种原因引起的甲状旁腺功能低下症 (HPT)的治疗效果均不甚理想 ,因此有必要探索新的治疗方法。为此我们通过逆转录病毒载体基因转移系统 ,将重组有人甲状旁腺激素基因 (PTH)逆转录病毒浓缩液感染造血干细胞后静脉注射入甲状旁腺功能低下小鼠血液中 ,获得较好的治疗效果 ,从而为进一步研究HPT的基因治疗奠定了基础。方法 :以保存的pcDNA3 1 PTH为模板扩增出PTH基因 ,然后通过脂质体转染法转染PA317包装细胞 ,以G4 18选择培养基筛选出阳性细胞克隆 ,收集其分泌的重组有PTH基因的病毒粒子 ,用于感染NIH3T3细胞以测定病毒…     

盆腔脾组织植入误诊1例报告

报道1例外伤性脾切除术后行盆腔脾组织植入的过程,对其病理机制及治疗要点进行分析和阐述。     

市场上常见伪劣中药的性状鉴别

由于利益的驱动，医药市场鱼龙混杂，中药掺伪使假的现象时有发生，较常见的有如下几种情况，介绍如下。     

小鼠胚胎干细胞转基因治疗甲状旁腺功能低下症的实验研究

目的　探讨小鼠胚胎干细胞 (TC 1)转基因治疗甲状旁腺功能低下症 (HPT)。方法包装出重组人甲状旁腺素 (PTH )基因的小鼠干细胞病毒 (MSCV) ,以其感染小鼠ESCs ,检测基因转导效率 ,PTH分泌情况 ;观察体内外分化情况 ,以及注入模型鼠体内各组小鼠血PTH和血钙变化情况。结果　获得滴度为 2× 10 7集落形成单位 (CFU ) /ml的重组逆转录病毒 ,经聚合酶链反应(PCR)扩增未检测到有野生型病毒存在 ,可以安全应用。感染TC 1的效率为 70 % ,每 10 6未分化TC 1每 48h分泌PTH约 10ng。重组有PTH基因的TC 1在体内外均可分化出三胚层组织 ,注入模型鼠体内 ,在观察期间实验组动物未再出现甲旁低表现 ,而且血PTH和血钙均保持在接近正常值范围内。结论　MSCV介导外源PTH基因可高效转导TC 1并持续分泌PTH ;体内外分化实验证明TC 1具有全能性 ,而且内环境并不是决定TC 1分化的唯一因素。经基因转导的TC 1可较好的改善模型鼠的症状 ,是未来细胞移植的一种潜在来源。     

氯沙坦对体外培养的犬胰岛细胞凋亡及凋亡相关基因表达的影响

目的探讨血管紧张素受体I拮抗剂(AT1Ra)氯沙坦对体外培养的犬胰岛细胞凋亡和凋亡相关基因表达的影响。方法机械自动化分离胰岛,纯化系统获得高纯度胰岛后,分为3组进行培养。(1)单纯培养组;(2)血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)组:培养基中加入不同浓度的AngⅡ(0.1、1.0和10.0μmol/L);(3)氯沙坦组:在加人不同浓度的AngⅡ前30min给予氯沙坦10.0μmol/L。各组胰岛培养48h后,采用透射电镜观察胰岛细胞凋亡情况;原位末端脱氧核糖核酸转移酶标记法(TUNEL)检测胰岛细胞凋亡百分率;免疫组织化学法和流式细胞术检测胰岛细胞凋亡相关基因(Bax和Bcl-2)的表达。结果单纯培养组胰岛细胞凋亡百分率为(5.70±1.18)%,AngⅡ组在AngⅡ浓度为0.1μmol/L、1.0μmol/L和10.0μmol/L时,胰岛细胞凋亡百分率分别为(9.77±1.95)%、(16.42±3.01)%和(18.22±2.31)%,氯沙坦组分别为(6.56±1.85)%、(9.25±1.58)%和(11.20±2.48)%,AngⅡ组与单纯培养组和氯沙坦组相比较,差异有统计学意义(P<0.05)。AngⅡ组Bax和Bcl-2基因表达增强,荧光指数(FI)分别为1.86±0.15和1.43±0.07,Bax/Bcl-2比值(1.30)升高;而氯沙坦组Bax表达下调至1.56±0.14,Bcl-2表达上调至1.67±0.09,Bax/Bcl-2比值(0.93)降低,两组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论AngⅡ可以诱导体外培养的犬胰岛细胞凋亡;而氯沙坦对胰岛细胞具有保护作用,其可能机制是通过影响凋亡相关基因Bax和Bcl-2的表达实现的。     

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目的探讨应用回肠蕈状双腔造口预防腹腔镜直肠癌全直肠系膜切除(TME)术后吻合口漏的可行性。方法回顾性分析2006年4月至2010年3月辽宁省肿瘤医院大肠外科应用回肠蕈状双腔造口术预防腹腔镜TME术后吻合口漏的65例(造口组)及同期未行预防性造口的腹腔镜直肠癌TME手术85例(未造口组)病人临床资料。腹腔镜下完成低位或超低位吻合后,造口组于距回盲瓣30～40cm处回肠于右髂前上棘与脐连线外1/3处行双腔造口,回肠沿与纵轴垂直方向切开达1/2周,近端做蕈状乳头高于皮肤0.5cm,远端回肠平坦式缝合于皮肤。骶前放置双腔引流管。术后3～5个月闭瘘。未造口组仅骶前放置双腔引流管。结果造口组病人粪便转流彻底。无造口周围皮肤严重腐蚀与不耐受,无死亡病例,无吻合口漏。未造口组5例出现吻合口漏,3例4～8周后愈合,2例行手术造口治疗后治愈,无死亡病例。结论应用回肠蕈状双腔造口术预防腹腔镜直肠癌TME术后吻合口漏是可行的,造口护理方便,闭瘘创伤小,粪便转流彻底。