PNPLA3基因慢病毒载体及其过表达Huh-7细胞系的构建

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)正在成为我国一个新的公共健康问题[1].PNPLA3 (patatin-like phospholipase domain-containing protein 3)基因I148M多态性与NAFLD密切相关,且此多态性参与了NAFLD的疾病进展[2-3].但是,其在NAFLD发病中的具体生物机制目前尚不明确.本实验利用基因重组技术,成功构建了携带PNPLA3基因野生型和I148M突变型的慢病毒载体,并感染人肝癌细胞株Huh-7细胞,建立了稳定过表达目的基因的细胞系,为深入研究PNPLA3基因的生物学功能提供了理想的细胞模型.     

人补体膜辅助调节蛋白MCP的基因克隆及共真核表达的研究

目的 克隆获得编码人补体膜辅助调节蛋白（ＭＣＰ）的ｃＤＮＡ，并对其在真核细胞的表达及功能进行研究。方法 应用ＲＴ－ＰＣＲ 方法，从Ｕ９３７细胞总ＲＮＡ中扩增编码人ＭＣＰ分子的ｃＤＮＡ片段，快速克隆于ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ载体，测定共序列。将该片段重组于ｐＬＸＳＮ载体，电穿孔转染ＮＩＨ３Ｔ３细胞，经ＦＡＣＳ检测筛选表达ＭＣＰ的阳性细胞克隆，用补体容破试验鉴定其抑制人补体溶破的功能。结果 ＲＴ－ＰＣＲ     

MicroRNAs途径在RAW264.7细胞中作用的初步研究

目的通过检测microRNAs生成的关键酶Dicer在RAW264.7细胞不同功能状态下的表达差异研究microRNAs途径在其中产生的作用。方法采用QRT-PCR、流式细胞术等对RAW264.7细胞在不同功能分化状态下的Dicer酶进行检测。结果GMCSF与MCSF分别刺激RAW264.7细胞诱导其增殖分化后,Dicer酶的mRNA水平显著增高,但随刺激时间呈现不同趋势(P<0.01);在诱导凋亡死亡状态下,RAW264.7中Dicer酶的表达下降30%(P<0.01);LPS与IL-4分别诱导RAW264.7细胞分化为M1和M2型,Dicer的表达与M1、M2型相关炎性因子的表达有相关性。结论 MicroRNAs调控途径参与并影响RAW264.7不同功能状态。     

55例急性缺血性脑卒中的治疗分析

目的探讨急性缺血性脑卒中的有效治疗方法。方法对55例急性缺血性脑卒中患者根据病情使用降血压、降血糖药和脱水剂、维持水电平衡;除应用舒血宁注射液、胞二磷胆碱注射液、抗血小板聚集药物外,加用依达拉奉注射液30mg加0．9％氯化钠注射液100ml中静脉滴注,2次／d,共14d。结果本组55例经治疗后,基本痊愈18例,显著进步25例,进步8例,无变化4例,总有效率92．7％。治疗期间,有3例出现谷丙转氨酶轻度升高,2例出现皮疹,未减药、停药而自行恢复。结论加用依达拉奉的综合疗法具有安全、有效、副作用小等特点,是治疗缺血性脑卒中的有效方法。     

重组跨模型人CD55分子在小鼠NIH3T3细胞上的表达及其补体溶破保护功能的研究

目的：在小鼠NIH3T3细胞转染表达人天然GPI锚固型CD55和重组跨膜型CD55-TM分子，观察比较它们对人补体溶破异源细胞的抑制功能。方法：将带有CD55cDNA、CD55-TMcDNA的重组逆病毒表达质粒CD55-pLXSN、CD55TM-pLXSN经脂腩体法转染PA317细胞，用病毒上清感染小鼠成纤维母细胞NIH3T3。经G418加压筛选，利用FACS检测获得表达CD55和CD55-TM分子的阳性细胞克隆，通过MTT比色法比较两种分子对人血清补体溶破细胞的抑制功能有无差别。结果：细胞转染筛选获得多个表达跨膜型人CD55分子的NIH3T3细胞克隆，补体杀伤试验证实其具有抑制人补体溶破的功能，且两种分子的补体抑制功能无明显差异。结论：成功地建立了稳定表达天然CD55、跨膜型CD55分子的小鼠NIH3T3细胞，证实其表达的GPI型CD55分子和CD55TM分子均具有抑制人补体溶破细胞的功能，为进一步探讨应用跨膜型的CD55分子对PNH进行基因治疗奠定了基础。     

跨膜型CD59分子的构建及其在小鼠NIH3T3和EL-4细胞表达的研究

应用ＲＴ－ＰＣＲ方法,从Ｕ９３７细胞总ＲＮＡ中扩增得到编码人ＣＤ４６分子跨膜区和膜内区ｃＤＮＡ片段,用ＰＣＲ方法扩增得到编码成熟的ＣＤ５９胞外区蛋白的ｃＤＮＡ片段,连接并构建了跨膜型的ＣＤ５９分子ｃＤＮＡ。快速克隆于ｐＧＥＭ－Ｔ Ｅａｓｙ载体进行序列测定,证实了其阅读框的完整和序列的正确性。     

人PD-1-Fc融合分子的构建及其在CHO细胞中的表达与鉴定

目的利用基因工程手段构建hPD1Fc重组cDNA,用真核表达系统制备有活性的hPD1Fc融合蛋白。方法PCR方法扩增编码hPD1膜外区的cDNA序列,将其与人IgG1Fc和pcDNA3.1( )片段连接,构建成hPD1Fc重组表达载体。用脂质体法转染CHO细胞,夹心ELISA法检测上清液中融合蛋白hPD1Fc的表达,经ProteinA亲合层析纯化,SDSPAGE、免疫印迹鉴定表达产物。结果PCR扩增得到编码人PD1全长的288aa编码基因片段,将其膜外区167aa的编码序列与hIgG1Fc的cDNA片段一起连接并插入pcDNA3.1( )表达质粒。重组质粒转染CHO细胞后,夹心ELISA法检测显示培养上清液中有hPD1Fc蛋白表达。纯化后的hPD1Fc蛋白经SDSPAGE和免疫印迹鉴定其相对分子质量约42800,与理论预测值相符。结论成功构建了hPD1Fc重组表达载体,利用哺乳动物细胞CHO表达出有活性的hPD1Fc融合蛋白,为进一步研究PD1分子在免疫耐受、自身免疫性疾病中的作用奠定了基础。     

LIHGT-HVEM/LTbR途径缺陷诱导T细胞的失能

目的探讨LIGHT-HVEM/LTbR信号通路缺陷对T细胞应答的影响。方法以LIGHTKO小鼠为动物模型,制备脾脏单细胞悬液,加入抗CD3mAb和抗CD28mAb刺激。通过3H-TdR掺入法检测了细胞的增殖能力、ELISA和FACS分别检测了细胞培养上清和胞内IFN-gamma和IL-10的水平,并探讨了这些细胞对外源性rIL-2的反应性。结果与野生型的C57BL/6小鼠相比,LIGHTKO小鼠的脾细胞表现为低下的增殖活性(P<0.05);细胞培养上清中Th1细胞因子IFN-gamma的水平显著下降(P<0.05);与ELISA结果一致,FACS胞内染色结果表明,IFN-gamma阳性T细胞的百分率显著下降,而LIGHTKO小鼠脾细胞IL-10的产生却显著高于野生型的对照小鼠(P<0.01)。进一步的研究表明LIGHTKO小鼠这种缺陷的IFN-gamma产生主要与CD8+T细胞亚群有关,而CD4+T细胞亚群IFN-gamma的产生是正常的。外源性rIL-2的加入可使LIGHTKO小鼠T细胞恢复正常的增殖能力和IFN-gamma的产生。结论 LIGHT-HVEM/LTbR信号通路缺陷导致T细胞的失能。     

尼莫地平辅助治疗高血压性脑出血51例临床观察

为了探讨高血压性脑出血的有效治疗方法,笔者采用尼莫地平辅助常规疗法对51例该病患者进行了治疗观察,现报道如下。