血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体的制备及鉴定

目的:制备血管内皮生长因子(VEGF)单克隆抗体(mAb),并对其特性进行鉴定.方法:以重组His-Trx-VEGF1-165蛋白为抗原,通过免疫、融合、克隆和筛选等方法制备VEGF mAb,制备小鼠腹水并测定其效价、染色体数目及免疫球蛋白亚类,用Western blot方法分析其特异性.结果:成功筛选出能稳定分泌的VEGF mAb杂交瘤细胞株4E4-H5,制备腹水的ELISA效价为1:106;染色体数目为105条;抗体分型为IgG1亚型,κ轻链;Western blot证实所获得的mAb可与VEGF全长蛋白发生特异性反应,但是与融合蛋白的标签蛋白His-Trx不发生反应.结论:制备的杂交瘤细胞株能稳定分泌高滴度和高特异性的VEGF mAb,为建立能够用于肝癌诊断的血清VEGF检测技术提供了参考.     

PrP八肽重复突变体对细胞生长影响的探讨

目的探讨PrP八肽重复突变体对细胞生长的影响。方法将具有遗传性朊病毒病相关不同八肽重复区插入突变的PRNP基因表达载体瞬时转染HeLa细胞,经噻唑蓝比色法(MTT)、Annexin-V/PI双染流式细胞检测。结果多八肽突变PrP蛋白对细胞的毒性作用较野生型明显增强。多八肽突变PrP较野生型更容易诱导凋亡发生,多八肽突变组早、晚期凋亡率均高于野生组。结论遗传性朊病毒病相关多八肽突变PrP蛋白可能较野生型更易诱导细胞凋亡发生。     

PrP可抑制tau介导的体外微管形成作用

目的研究朊蛋白（PrP）对微管相关蛋白（tau）介导的体外微管形成的影响。方法我们从兔脑组织中纯化出微管蛋白，并纯化出原核表达的tau和PrP蛋白。利用电子显微镜技术显示微管蛋白的聚集、tau对微管蛋白的聚集的影响，及PrP对tau介导的微管蛋白形成微管的影响。通过GST pull down实验研究tau与微管蛋白的相互作用，PrP对tau与微管蛋白相互作用的影响。结果电子显微镜负染显示纯化的微管蛋白在一定的实验条件下可聚集形成直径为25Nm的微管结构。在反应体系中加入tau后微管样结构的形成明显增加，而加入PrP后可显著地抑制tau对微管结构形成的促进作用。重组tau能与提取的天然微管蛋白在体外结合，而PrP可明显地抑制tau与微管蛋白的结合作用，并呈现剂量依赖关系。结论tau蛋白可促进微管蛋白形成微管结构，而PrP可通过与tau的相互作用抑制微管的形成。     

利用6σ质量标准对急诊实验室8台仪器的检测性能进行综合评价及质量改进

目的 利用6σ质量标准对急诊实验室8台仪器的检测性能进行综合评价并督促实验室持续质量改进。方法 选择8台仪器的46个检测项目为实验指标,以2017年上半年为质量改进前,下半年为质量改进后,收集8台仪器改进前的室间质量评价回报的偏倚和相应月份的室内质量控制的变异系数,以CLIA'88允许总误差为质量目标,按公式计算出σ值,从而综合评价8台仪器的检测性能。通过计算质量目标指数(QGI)值,找出问题所在,并从“人、机、料、环、法”方面下手,进行质量改进。之后收集改进后的室间质量评价回报的偏倚及相应月份的室内质量控制的变异系数,再次算出σ值,从而验证改进效果。结果 46个检测项目,质量改进前达到6σ以上的有27项,占58.7%; 5σ以上的有30项,占65.2%; 4σ以上的有35项,占76.1%; 3σ以上的有41项,占89.1%; 2～3σ的有5项,占10.9%。通过计算QGI值得知,需要改进精密度的有8项,需要改进准确度的有8项,需要改进精密度和准确度的有3项。改进后,除了NT-proBNP卫生部无第二次室间质评外,余45项,能够达到6σ以上的有34项,占75.6%; 5σ以上的有38项,占84.4%; 4σ以上的有40项,占88.9%; 3σ以上的有44项,占97.8%; 2～3σ的有1项,占2.2%。各阶段的σ值数量明显提高,质量改进已初见成效。结论 用6σ质量标准对仪器性能的综合评价能够促进实验室持续质量改进,能够为临床提供一份精准的检验报告,进而减少危急值的复检率,缩短报告的周转时间,大大提升了临床和患者的满意度。     

血清MMP9蛋白ELISA检测方法的建立及在肝癌患者血清检测中的初步应用

目的建立基质金属蛋白酶9（MMP9）的双抗体夹心ELISA检测方法，探讨血清中MMP9在正常人及肝癌患者中的差异。方法从人肝组织中经过反转录扩增出MMP9基因721—1156bp区段，插入到原核表达质粒pQE30中，在大肠埃希菌M15中诱导蛋白表达。以纯化的融合蛋白HIS—MMP9为抗原免疫实验用兔及豚鼠，得到的MMP9抗血清经过纯化后，建立双抗体夹心ELISA法。对227份正常及193份肝癌患者血清中的MMP9进行检测。结果SDS—PAGE显示所表达的HIS—MMP9融合蛋白相对分子质量约为17000；以原核表达蛋白为抗原制备的MMP9抗血清可有效地识别重组MMP9和中性粒细胞和HepG2细胞内源性MMP9蛋白；利用建立的MMP9 ELISA检测技术发现肝细胞癌患者血清中MMP9的含量高于正常人群，差异具有统计学意义，P〈0．001。结论建立的双抗体夹心ELISA方法可用于血清MMP9的检测，为建立以MMP9为检测指标的肝细胞癌患者转移复发筛查方法提供了科学基础。     

羊瘙痒因子263K经多种途径感染仓鼠的脑外组织PrP~(Sc)分子和沉积特点研究

目的　比较研究实验仓鼠经不同途径感染羊瘙痒病 (Scrapie)毒株 2 6 3K的终末期病鼠脑外组织内PrPSc分子和沉积特点。方法　以Scrapie 2 6 3K毒株经颅内、腹腔、心内、肌肉注射及灌胃等途径接种金黄地鼠 ,在终末期取脑、脊髓、脾、肾、舌、肌肉、小肠回盲部和胃组织 ,用HE染色观察病理变化 ,免疫组化法检测PrPSc的组织沉积特点 ,Westernblot检测PrPSc分子特征。结果　五种感染方式均可引起动物发病 ,在脑和脊髓组织中观察到典型的病理改变 ;PrPSc免疫组化检测显示外周途径感染动物脊髓白质内有大量沿纤维走行的PrPSc沉积 ,灰质前后角内围绕空泡点状或网状沉积 ,而颅内感染主要在中央管附近和后角出现大量的点状PrPSc沉积 ;脾脏、肾、小肠回盲部、胃组织中均观察到点状PrPSc的沉积 ;WesternBlot检测发现不同感染途径动物脊髓提取物均出现可抵抗蛋白酶消化的PrPSc条带 ,与脑提取物中PrPSc电泳性状完全一致 ;外周组织仅在脾脏检测到抵抗蛋白酶消化的PrPSc,但与正常对照比较 ,各种组织中PrP的总量明显增高 ,同时呈现与中枢神经组织不同的PrP电泳特征。结论　在TSE感染发病过程中 ,多种组织细胞成分可能参与了TSE感染因子的向中枢神经系统传递过程 ,PrP蛋白在中枢神经组织和其他外周组织细胞中的翻译后修饰及     

定位表达于溶酶体、泛素的PrP载体的构建及鉴定

目的 构建定位于溶酶体、泛素的PrP表达载体,并进行蛋白表达特点及定位的鉴定.方法 将泛素基因、溶酶体膜定位信号序列基因和PrP基因连接,克隆至pcDNA3.1载体中,构建表达载体pcDNA3.1-UPrP、pcDNA3.1-PrPL;瞬时转染真核表达细胞,经Western Blot和间接免疫荧光技术检测PrP表达特点.结果 构建的各种PrP定位表达载体均可定位表达具有三种类型的糖基化分子的PrP,以双糖基化分子类型最多.带有泛素、溶酶体信号的质粒pcDNA3.1-UPrP、pcDNA301-PrPL的PrP表达随着时间的延长蛋白表达量下降,提示泛素、溶酶体信号能加速表达PrP在细胞内的降解.结论 成功构建了溶酶体、泛素定位表达的PRNP核酸疫苗载体pcDNA3.1-UPrP、pcDNA3.1-PrPL,为PRNP核酸疫苗的研究奠定了一定的基础.     

改良序贯疗法与不同四联疗法根除幽门螺杆菌的疗效分析

目的：评价含呋喃唑酮的改良序贯疗法根除幽门螺杆菌（H ．pylori）的疗效和安全性。方法收集 H ．pylori 阳性的非萎缩性胃炎伴糜烂和消化性溃疡患者240例,均分为序贯疗法组（A 组）、伴同疗法组（B 组）、铋剂四联7 d 组（C 组）、铋剂四联10 d 组（D 组）。 A 组：先予雷贝拉唑10 mg ＋阿莫西林1000 mg ,每天2次,5 d ,再予雷贝拉唑10 mg ＋克拉霉素500 mg ＋呋喃唑酮100 mg ,每天2次,5 d ;B 组：雷贝拉唑10 mg ＋阿莫西林1000 mg ＋克拉霉素500 mg ＋呋喃唑酮100 mg ,每天2次,7 d ;C 组：雷贝拉唑10 mg ＋枸椽酸铋钾220 mg ＋阿莫西林1000 mg ＋克拉霉素500mg ,每天2次,7 d ;D 组：方案同 C 组,疗程10 d 。治疗结束停药至少4周后空腹行14C-尿素呼气试验,结果阴性者判为 H ．pylori 根除成功。结果224例患者完成治疗,A 、B 、C 、D 组H ．pylori 根除率按意向性（ITT ）分析分别为88．33％、83．33％、73．33％、81．67％,按方案（PP）分析分别为92．98％、90．90％、78．57％、87．50％。 A 组与 C 组 ITT 和 PP 分析比较差异均有统计学意义（χ2＝4．36、4．83,P＝0．037、0．028）。结论含呋喃唑酮的改良序贯疗法对 H ．pylori 根除率较高,是一种可供选择的一线治疗方案。     

用临床生化分析仪的室间质评回报靶值结果评价干式生化分析仪回归校准后的准确度

目的：用日立7170生化分析仪的室间质评回报靶值结果来评价Vitros350干式生化分析仪回归校准后的10个项目的准确度。方法用相同质控品分别在两台仪器上测试后上报卫生部临床检验中心,将 Vitros350卫生部室间质评回报结果代入回归校准方程后所得的数据与日立7170室间质评回报靶值结果进行偏差分析,以美国临床实验室修正法案（CLIA’88）规定的总误差范围为标准,在参考区间内,偏差＜1／2CLIA’88允许总误差,作为可比性的判断标准,即符合要求,在参考区间外,偏差＜CLIA’88允许总误差,作为可行性的判断标准,也符合要求,仪器也无需校准。如不符合要求的项目,则必须以日立7170为标准仪器,重新做 Vitros350的回归校准工作。结果7个项目的偏差均＜1／2CLIA’88允许总误差的要求,偏差（％）范围分别为 LDH 0．16～－9.89,CK 2.92～6.25,ALT －4.64～－8.07,TBIL 0.08～2.67,TP－0.37～4.41,ALB 2.74～4.77,URIC 1.04～3.0,不需要重新校准。而 GLU和CREA只有1份在参考区间外的标本的偏差＞1／2 CLIA’88允许总误差,而＜CLIA’88允许总误差的要求,其余标本的偏差范围均＜1／2 CLIA’88允许总误差,偏差（％）范围分别为 GLU －0.99～5.41,CREA－2.0～9.6,按规定,也无需校准,而BUN所求的偏差（％）范围为－23.7～－29.6,＞CLIA’88允许总误差,则必须重新做回归校准工作,以保证仪器的准确度。结论用临床生化分析仪的卫生部室间质评回报靶值结果来评价 Vitros350回归校准后的准确度是可行的,是经济的、适用的。