结直肠癌循环肿瘤细胞及DNA的研究进展

结直肠癌是最常见的恶性肿瘤之一,尽管联合应用手术、化疗、放疗可提高患者的生存率,但仍有大量患者因术后转移和复发死亡。循环肿瘤细胞及循环肿瘤DNA对结直肠癌的早期诊断、疗效监测、预后评估以及个体化治疗方案制定均有重要意义,已成为近年来研究的热点。本文对近年来结直肠癌循环肿瘤细胞及循环肿瘤DNA的检测技术及其在早期诊断、疗效监测和预后判断中的应用进展作一综述。     

利用微滴数字PCR进行CpG岛甲基化表型结直肠癌分子分型

目的：利用微滴数字PCR(droplet digital PCR, DD-PCR)技术进行CpG岛甲基化表型(CpG island methylation phenotype, CIMP)结直肠癌分型, 并探讨以血浆游离DNA进行CIMP分型的可行性。方法：收集2008到2012年在长海医院行结直肠癌手术的患者216例,抽提肿瘤组织DNA和血浆游离DNA, 重亚硫酸盐处理后,利用DD-PCR进行CIMP分型。CIMP分型选用CACNA1G、IGF2、NEUROG1、RUNX3、SOCS1五个基因的甲基化位点,利用免疫组织化学技术（IHC）检测P53突变情况, 以巢式PCR测序方法检测K-RAS 和BRAF突变。结果：216例肿瘤中17例(7.9%)存在BRAF突变, 96例(444%) 存在K-RAS 突变和112例 (51.9%) P53-IHC(+)。31.5%(68/216)的结直肠癌为CIMP（+）(5个基因位点中高甲基化位点数目≥3),823%(14/17)的BRAF突变属于CIMP(+), 而只有9.4% (9/96)的K-RAS 突变和7.1% (8/112) 的P53突变属于CIMP(+)。除了K-RAS ,BRAF和P53突变外,同CIMP（-）结直肠癌相比,CIMP（+）肿瘤还具有独特的临床病理特征：肿瘤更易发生在结直肠的近端位置,黏液性癌比例偏高,分化程度较高,CIMP(+) 患者生存时间显著短于CIMP (-)患者。利用血浆游离DNA进行分型和利用肿瘤组织进行分型的一致性为93.4%、灵敏度为872%、特异性为100%。结论：CIMP（+）结直肠癌具有独特的临床病理特征, 且预后较差;在缺乏肿瘤组织的情况下, 利用DD-PCR对血浆游离DNA进行CIMP分型是可行的。     

紫癜性肾炎患儿尿中血管紧张素原及丙二醛水平的测定及其临床意义分析研究

[目的]观察紫癜性肾炎(HSPN)患儿尿中血管紧张素原(AGT)及丙二醛(MDA)的表达水平,分析尿中AGT、MDA与尿检肾损伤各项指标之间的关系.[方法]选取2014年1月至2016年2月来本院就诊的46例hSPN患儿为研究对象(观察组),选取同期45例正常儿童作为对照组.分别检测两组受试儿童肾损伤指标及hSPN患儿治疗前后24h尿蛋白含量及AGT、MDA水平,并分析AGT、MDA与hSPN患儿肾损伤指标之间的相关性.[结果]治疗前,与对照组比较,HSPN患儿除尿β2微球蛋白/肌酐浓度外,其他各项肾损伤指标均有显著升高,24h尿蛋白及AGT、MDA含量均高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05);治疗后,HSPN患儿24h尿蛋白及AGT、MDA含量均较治疗前明显降低(P<0.01),表明hSPN患儿肾损伤得到一定程度改善.在HSPN发病过程中,AGT、MDA与肾小管及肾小球损伤的各项指标均有相关性.[结论]尿中AGT、MDA水平与HSPN患儿肾损伤程度具有相关性,说明肾素-血管紧张素系统及氧化应激反应参与了HSPN肾脏损伤过程.     

经皮椎体成形术治疗胸腰椎骨质疏松性压缩性骨折

目的 探讨经皮椎体成形术（percutaneous vertebroplasty,PVP）治疗胸腰椎骨质疏松性椎体压缩骨折的临床效果。方法 经单侧椎弓根入路向椎体内穿针并注入骨水泥（聚甲基丙烯酸甲酯）,手术前后疼痛程度应用视觉模拟分级法（visual analog scale,VAS）评分。结果 30例38个椎体PVP均获成功,手术时间20～120 min,平均50 min。术后2周VAS（2.7±0.2）分,与术前（8.0±0.2）分相比有显著性差异（t=21.92,P=0.00）。27例术后随访4～32个月,平均24.3月,胸腰背疼痛无再发或加重,椎体高度无明显变化,相邻椎体未见骨折。结论 PVP能迅速缓解疼痛,增加椎体强度和脊柱稳定性,适用于骨质疏松性脊柱骨折尤其多发性者。     

干湿法制粒技术在片剂生产中的对比应用

目的通过对不同制备工艺制得的曲克芦丁片(以下简称QK片)和复合磷酸酯酶片(以下简称FM片)进行比较,对两种片剂的制备工艺进行调整。方法采用湿法制粒工艺(以下简称SF工艺)和干法制粒工艺(以下简称GF工艺)分别制备QK片和FM片各三批,并对所制得的颗粒进行粒径分布、休止角、颗粒流动性、可压性、含量和效价测定及六个月的稳定性加速实验数据分析和比较。结果与SF工艺相比,GF工艺虽然在颗粒流动性和可压性方面相对不足,却可以明显提高某些热不稳定品种(如FM片)的稳定性。结论GF工艺技术作为近年来在国际上发展起来的新型造粒技术,在很多方面较SF工艺有着一定的优势,加上通过适当调整生产处方中辅料的用量,使其能够得到较为广泛的应用。     

人抗黏病毒蛋白-MxA基因克隆及在大肠杆菌中的表达

目的克隆人抗黏病毒蛋白-MxA基因,构建其原核表达载体并进行表达、纯化、活性鉴定,为深入开展该蛋白功能的研究奠定基础。方法从IFN-β诱导的A549细胞系中提取总RNA,通过RT-PCR技术扩增出MxA全长cDNA,克隆于pUC119载体,酶切鉴定后并经测序证实序列正确,再克隆于pET-32a（＋）载体上构建表达载体pET-32a（＋）-MxA,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达并优化诱导条件,通过NTA-Agarose亲和层析和割胶电洗脱法获取纯化MxA蛋白,用SDS-PAGE电泳分析表达产物,并通过对病毒VSV的抑制作用鉴定其活性。结果琼脂糖凝胶电泳结果显示RT-PCR扩增出两条片段,大小同预计片段相符,并经测序证实与公布的MxA基因序列一致;重组载体转化菌经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳初步鉴定,目的蛋白约占总菌体蛋白的25%,与预计的分子量91kd相一致。用NTA-Agarose亲和层析法可获得纯度〉95%的目的蛋白,割胶电洗脱回收法可获得纯度〉90%的目的蛋白。结论克隆了人抗黏病毒蛋白-MxA基因,克隆基因在大肠杆菌中获得了较高水平的表达,并通过两种方法获得了该蛋白的纯化物。     

人胚胎大脑皮层神经干细胞的分离培养

目的　为人神经干细胞的基础研究及临床应用提供细胞模型。　方法　采用无血清培养技术 ,分离培养了 10～ 14周人胚大脑皮层细胞 ,并用神经上皮干细胞蛋白 (Nestin)免疫组化鉴定培养细胞 ;5 %胎牛血清诱导其分化 ,神经丝 2 0 0 (NF 2 0 0 )和胶质纤维酸性蛋白 (GFAP)免疫组化鉴定分化细胞。　结果　获得了大量未分化、呈簇状悬浮生长的神经干细胞团 ,且能被诱导分化成神经元和神经胶质细胞。经传 12代后仍具干细胞特性。　结论　本实验成功地分离培养了人胚胎大脑皮层神经干细胞 ,为神经干细胞的基础研究和临床应用奠定了基础。     

定量蛋白组学揭示雷公藤红素抗卵巢癌的作用机制

目的 探讨雷公藤红素对卵巢癌细胞的增殖和迁移能力的抑制作用及其分子机制。方法 通过细胞增殖及迁移实验,明确雷公藤红素抗卵巢癌细胞增殖及迁移的能力;利用定量蛋白组学结合生物信息学分析差异表达蛋白,解析雷公藤红素对卵巢癌的作用机制;通过体外分子生物学技术,检测雷公藤红素对卵巢癌细胞EMT标志物（Cadherin）、细胞迁移关键蛋白（CD44与HMGB）的表达水平,以及对细胞活性氧（ROS）诱导水平的影响。结果 雷公藤红素显著抑制SKOV3及OVCAR3细胞增殖及迁移的能力。通过蛋白组学研究发现,经过雷公藤红素处理后,共有396个DEPs被鉴定出来（126个上调,270个下调）。GO和KEGG通路富集分析均显示雷公藤红素多靶点的抗肿瘤活性与细胞迁移、炎症、缺氧等生物过程密切相关。雷公藤红素下调N-cadherin,上调E-cadherin的表达抑制EMT,抑制CD44与HMGB1、HMGB2的表达来抑制卵巢癌细胞伤口愈合。此外,雷公藤红素诱导ROS的产生。结论 雷公藤红素具有多靶向抗卵巢癌活性,其可通过抑制EMT过程并诱导ROS的产生,抑制细胞迁移与增殖,发挥抗卵巢癌的作用。