水通道蛋白AQP4基因缺失加重NMDA诱导的小鼠脑损伤

目的:评价水通道蛋白AQP4在兴奋性氨基酸NMDA诱导脑损伤中起的作用。方法:在AQP4基因敲除小鼠,皮层注射NMDA 150 nmol诱导损伤。甲苯胺蓝染色评价损伤面积,Fluro-Jade B染色评价变性神经元,免疫组化法评价血脑屏障通透性增高。结果:与野生型小鼠比较,AQP4基因缺失加重NMDA诱导的皮层损伤,增加损伤区变性神经元密度,加重血脑屏障通透性的增高。结论:AQP4在NMDA诱导的脑损伤中可能起保护作用。     

FK866对非小细胞肺癌细胞迁移的影响

目的: 探讨低浓度烟酰胺磷酸核糖基转移酶（NAMPT）抑制剂FK866对人非小细胞肺癌细胞株（A549细胞）迁移的影响及作用机制。方法: MTT法检测不同浓度FK866对A549细胞增殖的影响;划痕实验检测1.0 nmol/L和10.0 nmol/L FK866对A549细胞迁移的影响;实时定量RT-PCR检测上皮间质转化相关蛋白上皮钙黏素和波形蛋白mRNA的表达量;蛋白质印迹法检测细胞外调节蛋白激酶1/2（ERK1/2）和磷酸化ERK1/2蛋白的表达量。结果: FK866作用时间越长、浓度越高,对A549细胞增殖的抑制作用越明显。FK866作用72 h时的半抑制浓度（IC₅₀）为9.55 nmol/L。以1.0、10.0 nmol/L的FK866预处理细胞48 h,划痕后继续给药48 h,两种浓度的FK866均能抑制A549细胞迁移;如不进行预处理,仅10.0 nmol/L浓度的FK866对划痕愈合有一定的抑制作用;1.0 nmol/L的FK866处理细胞72 h可上调上皮钙黏素和波形蛋白mRNA表达,并激活ERK1/2;以1.0 mmol/L的烟酰胺单核苷酸（NMN）或10.0 μmol/L的ERK1/2抑制剂U0126预处理,能够逆转FK866引起的上皮钙黏素和波形蛋白表达上调。结论: 低浓度FK866能够通过减少细胞内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和激活ERK1/2,增加上皮钙黏素表达,进而抑制细胞迁移,对肿瘤转移可能有一定的抑制作用;但其同时促进了波形蛋白的表达,不利于肿瘤的治疗。     

水通道蛋白4在小鼠脑老化中的作用

水通道蛋白4(AQP4)主要分布在星形胶质细胞足突膜上,是脑内最重要的水通道亚型。已经发现,AQP4除参与调节脑内水平衡外,还参加学习记忆、脑外伤、脑缺血、脑肿瘤等一系列生理、病理过程。脑老化伴随着学习记忆下降,以及易发生脑缺血、脑肿瘤等老年相关性疾病,但AQP4在脑老化中的作用尚未见报道。目的观察AQP4在小鼠脑老化中的作用。方法对年轻(2～3个月)和老年(17～19个月)AQP4基因敲除小鼠(AQP4-/-)与野生型相应年龄的小鼠(AQP4+/+),观察AQP4基因敲除对老年小鼠自发活动、学习记忆、大体脑形态以及神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞密度等的影响。结果老年小鼠自发活动减少,在穿梭箱被动避暗实验中,测试时进入暗箱的潜伏期明显短于年轻鼠,但AQP4+/+和AQP4-/-小鼠间无明显差异。甲苯胺蓝染色显示,老年小鼠皮层神经元密度(Ⅲ～Ⅳ层)显著低于年轻小鼠(P<0.05),海马CA1区厚度无明显差异,AQP4+/+和AQP4-/-小鼠间无明显差异。免疫组化显示,老年小鼠海马CA1的星形胶质细胞(GFAP阳性)数量明显高于年轻小鼠(P<0.01),而小胶质细胞数量在老年和年轻小鼠间无明显差异。免疫荧光显示,老年小鼠星形教胶质细胞的面积变小,而AQP4-/-小鼠的星形胶质细胞突起少而短、细胞面积明显小于AQP+/+小鼠(P<0.05),神经元和小胶质细胞形态无明显变化。结论 AQP4参与脑老化过程中的星形胶质细胞变化,而与运动、学习记忆相关的脑功能及神经元、小胶质细胞等脑结构变化无明显关系。     

新型P2Y样G蛋白偶联受体GPR17在脑缺血损伤中的作用

目的探讨新型P2Y样G蛋白偶联受体GPR17对脑缺血及缺氧缺糖(OGD)诱导皮层混合培养细胞中神经元损伤及小胶质细胞激活的影响。方法①以线栓法制备大鼠局灶性脑缺血模型,采用免疫组织化学、Western blotting、RT-PCR以及免疫荧光等方法观察脑内GPR17的时空表达及细胞分布特点。大鼠侧脑室埋管给予GPR17 siRNA靶向沉默脑内GPR17表达,观察其对脑缺血急、慢性期神经元损伤和小胶质细胞激活的影响。②以OGD诱导大鼠皮层混合培养细胞的缺血性损伤,以GPR17 siRNA靶向沉默GPR17的表达,观察其对OGD诱导的原代皮层混合培养细胞中神经元损伤和小胶质细胞激活的影响。结果①缺血中心区,GPR17 mRNA及蛋白水平在再灌注24 h和7,14 d表达上调;缺血周边区,再灌注7,14 d表达上调。在正常大鼠脑组织,GPR17主要表达于神经元、少突胶质细胞。在缺血中心区,再灌注24 h GPR17主要表达于损伤的神经元、小胶质细胞和少突胶质细胞,再灌注14 d主要表达于增生激活的小胶质细胞,部分表达于少突胶质细胞;而在缺血周边区,再灌注24 h以及14 d,GPR17主要表达于神经元、小胶质细胞和少突胶质细胞。星形胶质细胞不表达GPR17。大鼠侧脑室给予GPR17 siRNA成功抑制脑内GPR17表达,显著改善再灌注24 h神经症状、减少脑梗死体积以及神经元损伤;同样,也改善再灌注14 d的脑萎缩和周边区的神经元损伤,并显著抑制小胶质细胞的增生激活。②大鼠原代皮层混合培养细胞中,OGD 1 h恢复24 h(OGD/R)诱导细胞活性降低,LDH释放增加,PI染色结果显示细胞坏死增加,以神经元死亡为主。GPR17 siRNA处理后减轻OGD/R诱导的细胞活性下降以及LDH释放,并减轻细胞坏死,以减轻神经元死亡为主;GPR17siRNA处理后能够改善小胶质细胞激活的形态变化。结论大鼠局灶性脑缺血后,脑内GPR17表达上调,介导缺血后急性神经元损伤以及亚急性/慢性期的小胶质细胞激活。GPR17还介导OGD诱导的大鼠皮层混合培养细胞中的神经元损伤和小胶质细胞激活。     

鱼藤酮诱导BV2小胶质细胞半胱氨酰白三烯受体1表达变化

目的:制备和鉴定半胱氨酰白三烯受体1(CysLT1受体)抗体,以此观察鱼藤酮诱导BV2小胶质细胞损伤过程中CysLT1受体表达变化。方法:以KLH偶联的CysLT1受体多肽(小鼠)免疫家兔制备多克隆抗体,用ELISA法测定抗体效价,以抗原阻断法测定抗体敏感性及特异性。用新制备的抗体以Western blotting检测鱼藤酮(0.01～1μmol/L,作用24 h)损伤BV2细胞过程中,BV2细胞上CysLT1受体的表达变化,并以RT-PCR检测验证CysLT1受体mRNA表达水平,同时以免疫组化观察CysLT1受体的亚细胞分布变化。结果:ELISA测定显示,制备的兔抗小鼠CysLT1受体抗体的效价大于1/32728,对CysLT1受体的特异性强,对CysLT2受体和GPR17基本无交叉反应。Western blotting和RT-PCR显示,鱼藤酮作用BV2细胞24 h剂量依赖性诱导CysLT1受体mRNA及蛋白水平表达升高;免疫组化显示在鱼藤酮诱导BV2细胞损伤过程中,随鱼藤酮剂量增加,CysLT1受体发生核移位。结论:制备的CysLT1受体多克隆抗体具有高效价和高特异性,能满足Western blott...     

半胱氨酰白三烯受体激动剂和拮抗剂对大鼠胶质瘤C6细胞分化的作用

目的:探讨半胱氨酰白三烯受体在大鼠胶质瘤C6细胞的分化中的作用。方法:以激动剂LTD4、CysLT1受体拮抗剂孟鲁司特以及分化诱导剂forskolin处理C6细胞,观察细胞形态及GFAP蛋白表达变化。结果:Forskolin(10μmol/L)可诱导C6细胞形态变化及GFAP蛋白表达(细胞分化),而LTD4(0.1～100 nmol/L)不能诱导这些变化;单用孟鲁斯特(1μmol/L)无明显作用,但与LTD4(100 nmol/L)合用可诱导C6细胞分化。结论:CysLT2受体可能参与调节大鼠胶质瘤C6细胞的分化。     

新型半胱氨酰白三烯受体GPR17的多克隆抗体制备及其鉴定

目的:制备新型半胱氨酰白三烯受体GPR17的多克隆抗体(pAb),并鉴定其免疫学特性.方法:以KLH偶联的GPR17多肽免疫家兔制备其pAb,用间接ELISA法测定抗体效价,阻断ELISA测定抗体敏感性及特异性,同时以新制备的抗体做Western blot,检测GPR17的组织表达.结果:通过免疫家兔获得的抗GPR17 pAb,ELISA测定显示其抗体效价最高可达到1/16 364,并对CysLT1受体和CysLT2受体基本无交叉反应,具有较好的特异性.Western blot结果显示,GPR17在大鼠脑和心脏组织中有较高的表达,其分子量在43 kD左右.结论:制备的GPR17 pAb具有较高的效价和较好的特异性,能满足Western blot检测GPR17的要求.