重组pcDNA3．1-BMP7转染兔膝关节软骨细胞及其表达

目的：将重组pcDNA3.1-BMP7真核表达载体转染至培养的兔膝关节软骨细胞中，观察BMP7基因在兔关节软骨细胞中的表达。 方法：实验于2003-08／2004-08在哈尔滨兽医研究所完成。①选取清洁级健康成年家兔1只，兔膝关节软骨切碎后取2．0-2．5kg软骨组织，进行关节软骨细胞的分离与培养。②脂质体与pcDNA3.1-BMP7 DNA质粒形成脂质体-DNA质粒复合物，复合物的最佳比例为脂质体10μL、pcDNA3.1-BMP7质粒4μg。用含G418的正常培养液筛选转pcDNA3.1-BMP7质粒μg400mg／L的正常培养液筛选转染pcDNA3.1-BMP7DNA质粒的软骨细胞，显微镜观察细胞的形态及活性。③软骨细胞转染后7d和28d，分别用聚合酶链式反应、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、Western blot、免疫荧光、原位杂交检测等方法测定BMP7蛋白在软骨细胞中的表达。 结果：①家兔膝关节软骨细胞的分离与培养情况：家兔膝关节软骨切碎后用胰蛋白酶／Ⅱ型胶原酶进行消化，能使细胞与细胞外基质很好地分离。接种24h，部分细胞开始贴壁生长，72h后分裂增殖，7d时细胞融合率为90％～100％。贴壁初期细胞呈圆形或三角形，以三角形为主，每7d传代1次。②脂质体介导下pcDNA3.1-BMP7质粒转染兔软骨细胞情况：转染后的软骨细胞用G418筛选，4d转染效率约15％，阳性克隆细胞七八天融合率约为90％。G418连续筛选28d，阳性克隆细胞仍然存活，细胞融合率为100％。未转染pcDNA3.1-BMP7质粒的细胞，G418筛选4d时细胞全部死亡。③转染后兔软骨细胞聚合酶链式反应检测结果：聚合酶链式反应产物进行琼脂糖凝胶电泳分离，结果在1．3kb处可见DNA条带，作为对照的软骨细胞未见此DNA条带。④转染后软骨细胞BMP7蛋白表达电泳检测结果：在十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上可见相对分子质量约为18000的电泳条带。⑤转染后软骨细胞BMP7蛋白表达的Western blot检测结果：可见相对分子质量约为18000的特异性条带。⑥转染后软骨细胞蛋白表达的免疫荧光检测结果：转染7，28d的软骨细胞核周围均可见绿色荧光，未转染的软骨细胞未见BMP7蛋白表达。⑦转染后软骨细胞原位杂交检测结果：转染pcDNA3.1-BMP7质粒且G418筛选7，28d的软骨细胞细胞核周围均呈黄褐色，未转染的软骨细胞未见BMP7表达。 结论：用脂质体将pcDNA3.1-BMP7 DNA质粒转染至兔关节软骨细胞。BMP7在关节软骨细胞中获得表达，为软骨损伤的基因治疗及用作种子细胞构建组织工程软骨奠定实验基础。     

晚期癌症病人静脉穿刺护理体会

晚期癌症病人病程长,长期应用化疗药物和高浓度的营养药物对血管刺激性强,破坏性大,因此,行静脉穿刺时应特别注意保护其静脉,延长其使用寿命.为减少病人痛苦,应尽可能提高一次性静脉穿刺成功率.     

1例低血钾诊治及转归

低血钾为临床常见的水电解质紊乱之一，大多数为疾病的并发现象，少数为医疗之中合并出现，只有极个别为医疗中引发的需特殊处理的疾病。笔曾遇到1例术后严重水电解质平衡紊乱的患，住院60天才达到纠正，现报告如下。     

应用转BMP7基因软骨细胞构建组织工程软骨

目的：利用转BMP7基因软骨细胞构建组织工程软骨，测定BMP7基因在构建的组织工程软骨中的表达，探讨与未转BMP7基因软骨细胞构建的组织工程软骨的生物学差异。 方法：实验于2004—06／2005-01在哈尔滨医科大学附属第二医院临床药学药物研究所完成。应用转染重组pcDNA3．1-BMP7真核表达载体质粒并用G418筛选14d的阳性克隆软骨细胞，以胶原-纤维蛋白凝胶为支架，构建转BMP7基因组织工程软骨。以未转BMP7基因组织工程软骨作为对照，软骨细胞的接种密度为5&;#215;10^9L^-1。用甲苯胺蓝、苏木精-伊红染色对组织工程软骨培养物组织学分析；原位杂交法检测Ⅱ型胶原mRNA的表达；透射电镜观察组织工程软骨培养物的超微结构；原位杂交和免疫组化法测定体外培养物BMP7mRNA和蛋白的表达。 结果：①BMP7基因转染软骨细胞情况：G418筛选7d时大量细胞死亡，约30％的细胞存活，且贴壁生长。G418连续筛选14，28d均有阳性克隆细胞生成，贴壁生长率100％，存活的阳性克隆细胞为转染成功的软骨细胞。②组织工程软骨培养物大体形态及显微镜观察结果：构建的组织工程软骨培养物呈浅粉红色胶冻样圆盘状，透明，体积约为16mm&;#215;16mm&;#215;3mm。显微镜下只能观察到呈圆形的浅层细胞。③组织工程软骨培养物组织学分析结果：组织工程软骨培养物体外培养7，14，28d，细胞周围有丰富的细胞外基质，转BMP7基因组织工程软骨培养物细胞基质较多，体外培养14d软骨细胞合成和分泌最为活跃。④组织工程软骨培养物Ⅱ型胶原表达mRNA原位杂交检测结果：软骨细胞核周围呈棕黄色，有mRNA表达。⑤不同培养时间下组织工程软骨培养物DNA含量的测定情况：DNA含量随着培养时间的推移逐渐增加，21d时达到高峰，转BMP7基因比未转染BMP7基因的组织工程软骨培养物DNA含量高（P〈0．05）。⑥不同培养时间下组织工程软骨培养物糖胺多糖含量的测定情况：转BMP7基因组织工程软骨培养物体外培养34d时糖胺多糖含量最高，且各时间点糖胺多糖含量均高于未转BMP7基因组织软骨培养物（P〈0．05）。⑦组织工程软骨培养物的超微结构观察：与未转BMP7基因组织工程软骨培养物比较，体外培养7d，转BMP7基因组软骨培养物内软骨细胞细胞器发达，内质网、线粒体和高尔基体相对较丰富，细胞基质合成较旺盛；体外培养21d，转BMP7基因组织工程软骨培养物中软骨细胞粗面内质网仍较发达，线粒体和高尔基体相对减少，细胞基质合成能力减弱。⑧BMP7 mRNA表达原位杂交测定结果：体外培养7，14，21d，转BMP7基因组织工程软骨培养物软骨细胞中均有BMP7 mRNA表达，而未转BMP7基因组织工程软骨培养物未见软骨细胞表达BMP7 mRNA。⑨BMP7蛋白表达免疫组化测定结果：体外培养7，14，21d，转BMP7基因组织工程软骨培养物软骨细胞中均有BMP7蛋白表达，而未转BMP7基因组织工程软骨培养物未见软骨细胞表达BMP7蛋白。 结论：成功构建转BMP7基因组织工程软骨，其生物学特性优于未转BMP7基因软骨细胞构建的组织工程软骨，作为移植物修复软骨组织缺损具有一定的可行性和优越性。     

彩超估测儿童室间隔缺损肺动脉高压时排除负向分流干扰的临床价值

我院应用彩色多普勒超声心动图观察收缩期三尖瓣返流信号,取样容积避开室间隔缺损负向分流信号的干扰,在其返流信号最明亮处检测其返流速度,计算三尖瓣返流压差,进而估测肺动脉收缩压.通过对75例室间隔缺损合并三尖瓣返流且采取了先心病手术治疗的患儿检测,对比分析手术前后彩色多普勒超声心动图估测的肺动脉压力,并与术中用心腔穿刺测压法所测得的肺动脉压比较,两者高度相关,现将结果报告如下.     

二噁英诱导胎鼠腭裂组织中TGF-β3表达变化

目的 探讨转化生长因子( TGF-β3)在2,3,7,8-四氯二噁英(TCDD)诱导C 57 BL/6 J胎鼠腭裂发生中的作用.方法 在小鼠怀孕第10 d(GD 10),二噁英组以TCDD 64 μg/kg灌胃,对照组以玉米油16 mL/kg灌胃,于GD 18.5解剖显微镜下观察胎鼠腭裂发生率,并于GD 13.5、14.5、15.5剪取胎鼠腭突组织提取RNA及蛋白,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和western blot分别检测腭突组织中TGF-β 3 mRNA和TGF-β 3蛋白表达情况.结果 二噁英组腭裂发生率为100% (39/39),对照组无腭裂发生(0/42);在GD 13.5、14.5、15.5时,二噁英组TGF-β 3 mRNA相对表达量分别为(0.392±0.056)、(0.467±0.064)、(0.192±0.032),明显高于对照组(0.081±0.020)、(0.178±0.011)、(0.113±0.016)(P＜0.05);二噁英组TGF-β 3蛋白相对表达量分别为(0.046±0.009)、(0.089±0.015)、(0.028±0.003),明显高于对照组(0.017±0.001)、(0.039±0.003)、(0.005±0.001) (P ＜0.05).结论 TCDD可诱导C 57 BL/6 J胎鼠形成腭裂,并明显上调胎鼠腭突组织中TGF-β3表达.     

社区糖尿病患者自我管理行为与焦虑程度影响因素分析

目的 糖尿病患者容易在生理和心理上出现一系列不同程度的情感障碍.本研究探讨社区卫生服务中心糖尿病患者自我管理能力与焦虑程度关系,以提高糖尿病患者健康教育水平.方法 2019年8-11月对洋中社区卫生服务中心、瀛洲社区卫生服务中心、茶亭社区卫生服务中心、义州社区卫生服务中心和上海街道社区卫生服务中心管理的116例糖尿病患...     

在复方中加入蛇床子治疗卵泡发育不良

笔者在多年的临床实践中,对卵泡发育不良或无排卵性不孕症的患者,用促排卵药物不效时,在复方中加入蛇床子,疗效颇佳,现介绍如下。蛇床子具有温肾助阳,燥湿杀虫的功效,入肝肾二经,多用于湿热导致的痒证。笔者在1988年春遇一婚     

重组BMP7真核表达载体的构建及其对关节软骨细胞的转染

目的：构建pcDNA3.1-BMP7真核表达载体,并探讨转染关节软骨细胞的脂质体和DNA的最佳比例及BMP7基因表达。方法：构建pcDNA3.1-BMP7真核表达载体。用脂质体将pcDNA3.1-BMP7包裹形成DNA脂质体复合物,转染家兔关节软骨细胞,G₄₁₈筛选。转染过程中确定脂质体浓度、脂质体与pcDNA3.1-BMP7质粒的比例。原位杂交、PCR、Western blotting测定BMP7表达。结果：构建了pcDNA3.1-BMP7真核表达载体,脂质体与 pcDNA3.1-BMP7质粒最佳转染浓度为3 mL培养液中加10 μL脂质体和4 μg pcDNA3.1-BMP7质粒(2.5∶1);以400 mg·L^-1 G₄₁₈的正常培养液筛选28 d,BMP7为阳性表达。结论：在脂质体介导下,pcDNA3.1-BMP7转染家兔关节软骨细胞获得成功,且BMP7在该细胞中稳定表达。