反向斑点杂交检测甲/乙型流感病毒及其基因分型的方法研究

目的建立一种特异、灵敏的检测甲/乙型流感病毒并对其进行基因分型的反向斑点杂交方法。方法应用生物软件针对甲/乙型流感病毒的膜蛋白（Matrix Protein）基因和血凝素（Hemagglutinin,HA）基因的保守区域设计引物及探针,通过优化PCR和杂交的反应条件,建立检测甲/乙型流感病毒并对其进行基因分型的反向斑点杂交方法,验证方法的特异性和敏感性,并与直接免疫荧光法分别对相同的临床咽拭子标本进行检测,比较两者的检测结果,以评价该方法的临床应用价值。结果该方法对甲/乙型流感病毒的检测具有特异性,对呼吸道合胞病毒、柯萨奇病毒A型、副流感病毒3型、鼻病毒和腺病毒3型均无交叉反应,检测灵敏度为102～103copies/μL。在111例发热门诊病人的咽试子标本中,免疫荧光检测出3例甲型流感病毒、0例乙型流感病毒,阳性率为2.7%;反向斑点杂交检测出3例甲型流感病毒,其中1例H1、2例H3、0例H5、0例H9,4例乙型流感病毒,阳性率为6.3%。结论初步应用结果表明,本研究建立的检测甲/乙型流感病毒并对其进行基因分型的反向斑点杂交方法具有特异、灵敏的特点,为该方法的后续临床应用奠定基础。     

幼儿急疹98例诊治体会

幼儿急疹多发于6个月至18个月的婴幼儿，是由人疱疹病毒6型引起的一种疾病，热退后出疹是幼儿急疹的主要特点。常在高热3～5天后，皮疹在热退和热度将退时出现。但在发病初期与上呼吸道感染似乎没有差别，但本病3～5天的高热期会给家长带来恐慌，为了能在病初即可较明确的诊断该病，特别帮助年轻医师更好的认识该病的特点，以向家长交待好预后，笔者总结分析96例幼儿急疹的临床特点，现报告如下：     

润秘方灌肠联合“三字经推拿”治疗小儿便秘的临床研究

目的观察润秘方灌肠联合"三字经推拿"治疗小儿便秘的临床疗效。方法将60例患儿随机分为治疗组30例,对照组30例,治疗组予以润秘方灌肠联合"三字经推拿"疗法治疗,对照组予以口服乳果糖口服液。结果治疗组疗效明显优于对照组,差异有显著性(P0.05)。结论润秘方灌肠联合"三字经推拿"治疗小儿便秘,疗效显著,优于口服乳果糖口服液。     

bFGF人源性抗体Fab段基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的 用自身免疫病患者外周血淋巴细胞获得的bFGF人源性抗体Fab基因,构建编码人源性bFGF抗体Fab表达载体在大肠杆菌中表达,检测其结合抗原的活性.方法 从筛选获得的噬菌体抗体质粒pComb3-Fab中,PCR再扩增出Fd段和κ链基因,克隆到pMD18-T载体中并测序,在NCBI/GenBank的Ig BLAST数据库进行BLAST序列分析.鉴定Fd段和κ链基因后,插入到表达载体pComb3H,切除gene Ⅲ,构建bFGF抗体Fab可溶性表达载体,并在XL1-Blue菌中表达.用SDS-PAGE、Western blot和ELISA方法 鉴定表达产物.结果 Ig BLAST数据库进行BLAST序列分析结果 显示,Fd-6、Fd-25、Fd-26的FWR区与数据库中人源抗体序列FWR区的同源性为95%、97.4%、94.3%,3个CDR区均为特异性序列,证实为人源性抗体Fd段和κ链基因.SDS-PAGE和Western blot检测到目标蛋白带.ELISA结果 显示,表达产物Fab具有与重组人bFGF特异性结合活性,与Human TNF-α、Human IL-2均无交叉反应.结论 插入到表达载体pComb3H的来源于人源性噬菌体抗体库的Fab基因证明为人源性抗体基因,该基因可在XLl-Blue菌株中可溶性表达,且具有特异结合抗原的活性.     

自拟方治疗小儿风寒感冒120例

笔者采用中医辨证论治方法治疗急性上呼吸道感染早期,即中医诊断为风寒感冒的患儿,比单纯应用西医治疗风寒感冒疗效好,现将结果报道如下。一般资料全部患儿均为门诊病例。治疗组120例,男性63例,女性57例;年龄6个月～2岁45例,3～6岁42例,7～14岁33例。对照组128例,男性68例,女性60例;年龄6个月～2岁46例,3～6岁40例,7～14岁42例。两组病程均少于3天,所有病儿均符合风寒感冒的临床诊断标准。随机分为两组,两组一般临床资料经统计学处理无显著性差异,具有可比性。     

支气管镜检查在儿童大叶性肺炎的临床应用

目的 探讨儿童大叶性肺炎的临床特点和支气管镜诊治效果.方法 选择2012年1月至2014年12月广州医科大学附属第一医院儿科住院的210例大叶性肺炎患儿,其中支气管镜组122例,内科治疗组88例.对其临床表现、病原学检查等资料进行统计学分析.内科治疗组给予抗感染、化痰等药物进行治疗,支气管镜组则在内科治疗的基础上采用支气管镜肺泡灌洗术进行介入治疗.密切观察患儿的住院的天数、发热缓解的时间、咳嗽缓解的时间、肺部啰音消失的时间等.结果 支气管镜组患儿的住院天数、发热缓解时间、咳嗽缓解时间、肺部啰音消失时间均少于内科治疗组,差异均有统计学意义(P＜0.05),两组在治疗前后2周复查的影像学均有不同程度吸收,差异无统计学意义.但其中重症肺炎患儿经支气管镜行支气管肺泡灌洗术治疗后,其发热缓解时间、临床体征改善时间、住院天数以及治疗前后2周复查的影像学吸收改善情况则显著优于重症内科治疗组,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 大叶性肺炎患儿在内科治疗基础上经支气管镜介入治疗,能够促进病情恢复,尤其在重症大叶性肺炎.     

广州市成人流感样疾病882例病原学及临床特征分析

目的 探讨引起广州地区成人流感样疾病(influenza like illness,ILI)的呼吸道病毒病原学分布及其临床特征.方法 2009年1-9月份采集882例成人ILI患者的鼻和(或)咽拭子,应用小瓶离心法进行病毒分离与鉴定,并对患者的临床特征进行分析.结果 (1)病原学分布:882份鼻和(或)咽拭子标本中,病毒培养阳性385份(43.7%),共检测出9种病毒,以季节性甲型流感病毒为主,共259例(67.3%),其余分别为乙型流感病毒107例(27.8%);人副流感病毒(HPIV)1～3型5例(1.3%);腺病毒、单纯疱疹病毒1型(HSV-1)及肠道病毒各2例(0.5%);混合感染8例(2.1%),其中季节性甲型流感和乙型流感病毒混合感染6例,乙型流感病毒与HPIV-3混合感染1例,腺病毒与呼吸道合胞病毒(RSV)混合感染1例.2009年3-5月份以乙型流感病毒为优势毒株,6-8月份则以季节性甲型流感病毒为主;(2)临床特征:ILI患者以18～30岁人群为主(49.7%),中度发热、咽喉痛及咳嗽为主要临床症状,上呼吸道感染和肺炎的比例为88.4%(727/882)和10.7%(95/882).季节性甲型流感和乙型流感的临床症状相似,流感病毒检测阳性组的白细胞和淋巴细胞平均数均较病毒阴性组低.腺病毒、HPIV及RSV感染者年龄较低,肠道病毒与疱疹病毒感染者未出现皮疹.结论 (1)引起2009年广州地区成人ILI的病原以季节性甲型流感和乙型流感病毒为优势病毒,其他呼吸道病毒散发,病毒病原体多样化特征不明显,呈季节性流行;(2)不同病毒感染的成人ILI患者发热程度不同,伴有明显的全身和上呼吸道症状,肺炎少见.     

应用空斑形成法检测五种不同细胞对肠道病毒71型的敏感性

目的:建立肠道病毒71型(EV71)的空班形成方法, 并比较BGM、VeroE6、MRC-5、HEp-2及A549五种细胞对EV71病毒的敏感性.方法:将不同稀释浓度的EV71病毒接种到五种细胞, 分别覆盖三种不同的培养物, 孵育一定时间后固定染色, 比较出斑效果;以新建空斑形成法测定五种细胞感染EV71 24-96 h后培养液滴度, 计算空班形成单位(pfu).结果:在五种细胞中, BGM和VeroE6覆盖琼脂糖凝胶的EV71可形成针尖样空班;覆盖1%甲基纤维素的EV71可形成直径大约1 mm圆形或类圆形空班, 形成空斑单位最多, 病毒滴度分别达2.87×109 pfu/L和1.65×109 pfu/L;覆盖1.2%艾维素的EV71在BGM细胞中可形成直径大约0.5 mm类圆形空斑, 在VeroE6细胞中形成针尖样空斑;其他细胞均形成针尖样空斑.结论:空斑形成方法可对肠道病毒进行定量检测, BGM及VeroE6细胞为EV71的敏感细胞.     

金刚烷胺与利巴韦林对不同甲型流感病毒株的体外作用敏感性比较

目的评价金刚烷胺和利巴韦林对不同甲型流感病毒株的体外抑制作用,为临床选择抗流感病毒药物提供实验依据。方法分别接种甲型流感病毒标准实验株[H1H1(A/PR/8/34、A/FM1/47),H3N2(A/Aichi/2/1968)]和临床分离株[H1N1(A/Guangzhou/GIRD02/2009、A/Guangzhou/GIRD166/2009),H3N2(A/Guangzhou/GIRD18/2009、A/Guangzhou/GIRD26/2009)],于狗肾细胞(MDCK),采用空斑试验观察金刚烷胺和利巴韦林对甲1和甲3型流感病毒不同实验株和分离株的敏感性。对测试毒株的MP基因进行序列测定和分析,了解金刚烷胺的药物敏感性。结果金刚烷胺在MDCK细胞的半数毒性浓度(TC50)为335μg/ml,对部分甲型流感病毒标准实验株[A/FM1/47(H1N1)、A/Aichi/2/1968(H3N2)]及临床分离株[A/Guangzhou/GIRD02/2009(H1N1)]有抑制作用(半数有效浓度IC50分别为14.9、20.1、16.8μg/ml)。利巴韦林的TC50为2.05mg/ml,对测试的所有毒株均有抑制作用(IC50为6.8～37μg/ml)。金刚烷胺耐药毒株均为单位点突变(第31位的丝氨酸S置换为天冬酰胺N,S31N)。结论甲型流感病毒对金刚烷胺较易出现耐药,而利巴韦林体外对金刚烷胺敏感株和耐药株均有显著的抑制作用,临床抗流感病毒治疗时可考虑应用。     

甲型流感病毒空斑形成技术的改进和应用

数为0.01,高峰期为感染后第4天.结论 该方法经改进可应用于标准病毒株及临床样本的病毒定量检测和确定流感病毒最佳感染复数;低MOI感染复数易于获得高滴度流感病毒.