面对基因诊断技术发展的挑战

近十年来,以DNA分析为基础的基因(核酸)诊断技术已逐步成为实验诊断的常规技术而广泛应用于临床各学科领域,包括遗传学、肿瘤学、传染病学、血液学、输血和免疫学等方面。核酸检测技术的快速发展和疾病基因组研究信息日新月异,并由此带来的巨大产业前景和社会需求,使我国医药卫生工作者、从事诊     

PCR循环测序法检测K-ras和HCV 5'非编码区基因变异

目的：建立一种简单、快速、可靠的ＤＮＡ序列分析方法，并利用此方法分析Ｋｒａｓ基因和ＨＣＶ５′非编码区基因的变异情况。方法：ＰＣＲ循环测序法是将ＰＣＲ扩增与核酸序列分析相结合的一种研究方法。根据此技术原理，建立了以ＰＣＲ扩增引物为测序引物，利用ＴａｑＤＮＡ聚合酶、荧光标记的２′，３′双脱氧核苷三磷酸（ｄｄＮＴＰ）直接进行ＰＣＲ扩增产物序列分析的方法。应用该方法对人肺癌组织中的Ｋｒａｓ癌基因和丙型肝炎病毒５′非编码区（ＨＣＶ５′ＮＴＲ）进行了序列测定。结果：肺癌组织中的Ｋｒａｓ基因第１外显子第３５位碱基发生点突变（ＧＧＴ→ＧＡＴ）；属于高度保守区的ＨＣＶ５′ＮＴＲ存在基因变异。结论：ＰＣＲ循环测序法具有简单、快速、结果可靠等特点，为基因突变的检测和病原体的核酸序列分析提供了一个快速实用的方法。     

人周围神经内乙酰胆碱酯酶活性与神经束性质的鉴别

本文用Karnovsky乙酰胆碱酯酶组织化学方法,系统地观察了成人周围神经中乙酰胆碱酯酶的分布。材料包括20侧上肢主要神经干及其分支、部分下肢神经的肌支和皮支、6侧C_7脊神经前后根。皮神经内,有髓纤维酶反应阴性;大量无髓纤维显示强阳性酶反应,呈群块状分布。肌支神经内58%的有髓纤维酶反应阳性,酶活性局限于轴索内,髓鞘不显酶活性;示强阳性酶反应的无髓纤维远较皮神经少。C_7脊神经前根87%有髓纤维酶反应阳性,与肌支内酶反应阳性有髓纤维相似;后根纤维酶反应阴性;灰交通支内酶反应强阳性,与皮支内阳性无髓纤维酶染色强度一致。本文结果表明,周围神经运动束和感觉束内,有髓及无髓纤维酶活性都有明显不同;明确提出,酶染色有髓纤维来源脊神经前根运动纤维,具有强酶活性的无髓纤维是交感神经节后纤维。     

SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测DNA甲基化方法的建立

近期，表观遗传学与肿瘤发生关系的研究日益增多。DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分，并已成为肿瘤早期诊断的研究热点。甲基化特异性PCR（MSP）是检测DNA甲基化的常用方法之一，该方法灵敏度和特异度高，但操作繁琐，难以自动化。TaqMan荧光定量PCR法，即Methylight在MSP的基础上设计1条TaqMan探针，该方法的准确性和检测的灵敏度都很高。然而，因需要设计合成特异的探针而使其的应用受限，而且TaqMan探针昂贵。本研究建立SYBRGreenⅠ荧光定量PCR（FQ—PCR）检测DNA甲基化的方法，通过临床标本检测和对比试验，以证明其与Methylight的检测效能，以便为DNA甲基化检测的临床应用提供工具。     

慢性粒细胞白血病患者外周血WT1 mRNA的表达水平

目的 :建立 real time RT- PCR检测 WT1基因表达的方法 ,了解慢性粒细胞白血病 (CML )患者外周血WT1基因的表达水平。方法 :建立 real time RT- PCR方法 ,用 PE ABI 770 0 PCR仪检测 CML 39例、非白血病 2 6例和正常人 36例外周血中 WT1基因的表达水平。结果 :急性变 5例平均表达水平 (312 0 0 0± 12 6 96 5 )拷贝 /μg RNA,加速期19例平均表达水平 (186 5 2± 2 2 879)拷贝 /μg RNA,慢性期 15例平均表达水平 (15 4± 182 )拷贝 /μg RNA。结论 :WT1基因在 CML外周血中有高水平的表达 ,可作为疗效考核及监测微残留病的指标。     

反向斑点杂交技术检测HBV基因型方法的评价

目的评价用于检测乙型肝炎病毒(HBV)基因型的反向斑点杂交(RDB)方法。方法应用RDB检测723例HBV阳性标本的HBV基因型。其中对423例HBV序列测序结果清晰可读的样本进一步使用NCBI在线数据库分析、系统进化法分析其HBV基因型,并与RDB法结果进行比较。将样本HBV序列与所用的探针序列进行比对,以评价单个碱基突变对该方法的影响。结果 RDB法检测的检出率为97.6%。RDB检测结果与NCBI在线数据库分析法的一致性为98.8%;与系统进化分析法一致性为100%。与对应探针有1个碱基差异的HBV A型1例、B型12例、C型46例和D型1例均被成功检出。结论 RDB是一种灵敏、准确、有效,且具有很高临床应用价值的HBV基因型检测方法。单碱基的突变不会影响其对HBV的分型结果。     

儿童胃黏膜白细胞介素mRNA水平与幽门螺旋杆菌感染的研究

目的分析儿童胃黏膜白细胞介素(IL-1β)水平与幽门螺旋杆菌(H.pylori)及其高毒力亚型感染间的相关性。方法实时定量聚合酶链(real-time PCR)检测H.pylori的保守基因ure以判断H.pylori的感染,高毒力亚型基因vacA s1用real-time PCR检测,用PCR扩增另一高毒力基因cagA羧基端EPIYA基序所在区,然后测序确定其亚型。IL-1βmRNA使用PCR-荧光探针法检测,比较循环CT法分析。结果患儿中无论是低毒力还是高毒力的H.pylori感染都与胃黏膜IL-1βmRNA水平无显著相关性。结论 H.pylori对儿童胃黏膜IL-1β表达的影响作用并不明显,可能还有其他一些环境、遗传因素如IL-1基因簇多态性与H.pylori共同作用调节胃黏膜IL-1β的表达。     

微量胃黏膜IL-1β mRNA水平Real-time PCR检测方法的建立

目的建立微量IL-1βmRNA表达水平的Real-time PCR检测法。方法 20例消化道疾病患儿的胃粘膜用来做本次研究。IL-1βmRNA水平检测使用Real-time PCR荧光探针法,保守基因GAPDH做内参,采用比较循环CT法分析IL-1βmRNA的表达量。结果运用IL-1βmRNA Real-time PCR荧光探针法检测出了20例消化道疾病患儿胃粘膜IL-1βmRNA的表达量。结论成功建立了微量胃粘膜IL-1βmRNA水平Real-time PCR检测法,为IL-1β在胃肠道疾病发生发展过程中的研究提供了有力工具。     

组织化学法对人周围神经内神经束定性和定位的研究

周围神经显微外科技术的应用,对神经束性质的鉴别提出了更高的要求。作者用Karnovsky乙酰胆碱酯酶(AChE)组织化学方法,对成人上肢主要神经干及其分支和部分下肢神经肌支和皮支、脊神经前后根及灰交通支内AChE分布,进行了全面的观察。材料均从死亡后三小时内的成人尸体上获得,按神经在体内的自然位置,以印度墨汁在神经外膜上标记方位。取材后,用6％的中性甲醛固定1h,磷酸缓冲液冲洗,明胶包埋(45°～50℃、1h)。冷凝后冰冻切片(15～20μm)。贴片后入Karnovsky标准孵育液内孵育(4℃,20h)。孵育对照:1.不加     

橈神经功能束定位的组化法研究

用乙酰胆碱酯酶组织化学方法对20侧成人桡神经进行了研究,材料从死后3小时内的尸体上获得。在切片上重点观察了桡神经在臂部的六个断面神经束和束组的性质、数量、大小和分布,并对结缔组织和神经束的面积及其比例进行了测量和统计分析。据此提出,在桡神损伤中,应根据损伤部位的解剖学特点,采取相应的手术方式。