CRISPR-Cas9基因编辑报道系统应用于AAVS1安全港的定点整合

摘要:目的 利用ZFN 与 TALEN 基因编辑以及同源重组技术将 Cas9表达框、基因编辑效率荧光报道系统以及真 核细胞筛选标记的 DNA 超长片段定点插入 HEK-293T 细胞基因组 AAVS1安全港,建立可用于衡量 CRISPR-Cas9基 因编辑的稳定 细 胞 株。方 法 利 用 分 子 克 隆 技 术 构 建 AAVS1-all-in-one-CRISPR 质 粒。利 用 脂 质 体 将 识 别 并 切 割 AAVS1基因组序列的ZFN 和 TALEN 质粒以及 AAVS1-all-in-one-CRISPR质粒共转染入 HEK-293T细胞。使用嘌呤 霉素筛选获得单克隆细胞后,利用杀稻瘟菌素S筛选、红色荧光检测、Cas9 Westernblot以及基因组 PCR 鉴定等方法获 得 CRISPR-Cas9基因编辑报道系统完整整合入 AAVS1安全港的稳定细胞株。继而,将 EGFP修复模板单链 DNA 及 EGFPsgRNA 瞬时转染入这些稳定细胞株,对失去荧光的 EGFP进行基因编辑,恢复其发光功能,并通过荧光检测技术 验证基因编辑结果。结果 成功获得3株同时具有嘌呤霉素和杀稻瘟菌素 S抗性以及表达红色荧光蛋白的单克隆细 胞,Westernblot证实其成功表达 Cas9蛋白,基因组 PCR 鉴定目的基因成功整合入基因组 AAVS1位点。经 EGFP基 因编辑后,细胞恢复绿色荧光。结论 利用 ZFN 与 TALEN 将完整的 CRISPR-Cas9基因编辑报道系统成功整合入 HEK-293T细胞基因组的 AAVS1安全港,整合 DNA 片段长度达11.5kb,并利用 Cas9成功编辑 EGFP报道基因。     

肝细胞癌术后肝外转移的相关临床病理学因素分析

目的 探讨肝细胞癌(HCC)术后肝外转移相关的临床病理学参数.方法 纳入HCC根治术患者66例,随访术后肝外转移情况,中位随访时间31.7个月.临床病理学参数与肝外转移的相关性分析采用Log-rank检验、Kaplan-Meier曲线和多变量Cox风险比例模型.结果 单因素分析结果显示,合并高血压、无完整肿瘤包膜和肿瘤分期Ⅲ期与HCC术后肝外转移风险呈正相关(均P＜0.05),而低血小板计数和血浆凝血酶原时间延长与肝外转移风险呈负相关(均P＜ 0.05).进一步多因素Cox回归分析显示,合并高血压和肿瘤Ⅲ期与HCC术后肝外转移显著相关(均P＜0.05).结论 合并高血压以及高肿瘤分期是HCC术后肝外转移的独立风险因素.     

LC-MS/MS测定硫酸氢氯吡格雷中的痕量四乙基溴化铵

目的 建立LC-MS/MS测定硫酸氢氯吡格雷中的痕量四乙基溴化铵。方法 采用Waters Atantis HILIC silica色谱柱（2.1 mm×100 mm,5 μm）,以甲酸铵缓冲液（0.05 mol·L^-1甲酸铵的0.1%甲酸溶液）-乙腈（15︰85）为流动相,流速为0.2 mL·min^-1,柱温35℃,进样体积1 μL。采用三重四级杆质谱仪在正离子模式下多反应监测（MRM）模式对硫酸氢氯吡格雷中的四乙基溴化铵进行定量检测。结果 四乙基溴化铵在0.005 0~1.993 3 μg·mL^-1内线性关系良好（r=0.999 8）,加标回收率为94.9%（n=9）,重复性RSD为1.8%,定量限为0.14 ng·mL^-1。6批样品中四乙基溴化铵均未超出检出限。结论 本方法准确、快速、灵敏、重复性好,适用于硫酸氢氯吡格雷中的痕量四乙基溴化铵的测定。     

奥硝唑氯化钠注射液主要杂质的结构鉴定

目的:对奥硝唑氯化钠注射液的主要杂质进行结构分析。方法:采用HPLC-QTOF-MS联用技术对该杂质进行鉴定;利用制备高效液相色谱从奥硝唑氯化钠注射液中分离制备该杂质,并进一步采用核磁技术进行结构确证。结果:确证了奥硝唑氯化钠注射液的1个主要杂质的结构。结论:本研究对奥硝唑氯化钠注射液的杂质分析、质量控制具有重要作用。     

江苏省连云港市乡镇卫生院患者满意度及影响因素分析

目的:了解患者对乡镇卫生院的满意度,并分析其主要影响因素,为提高乡镇卫生院服务水平、推进基层卫生事业发展提供参考依据。方法:采用分层抽样的方法,抽取连云港市2个县,对其8家乡镇卫生院的120名患者进行问卷调查,并运用因子分析和Logistic回归分析筛选出主要影响因子以及社会学影响因素。结果:总体满意得分为3.36分,影响患者满意度的主要因子依次为服务质量、服务环境及收费、服务效率;影响患者满意度的社会学因素依次为年龄、文化程度和家庭年收入。结论:乡镇卫生院必须从提高服务质量、改善服务环境、提升服务效率等方面加强自身建设,提高患者满意度。     

不同来源复方甘草酸铵注射液中氨基酸稳定性差异及降解成因研究

目的:建立HPLC法测定复方甘草酸铵注射液中甘氨酸与盐酸半胱氨酸的含量，运用离子色谱法测定抗氧剂亚硫酸根离子及氧化产物硫酸根离子的含量，并对不同来源样品的氨基酸稳定性差异及降解成因进行研究、分析。方法:HPLC法采用Agilent Eclipse XDB-C₁₈色谱柱(150 mm×4.6 mm, 5μm),流动相为甲醇-0.01 mol·L^-1磷酸盐缓冲液(磷酸调pH至2.15±0.02)(5∶95),检测波长为210 nm。离子色谱法采用IonPac AS11-HC柱(250 mm×4 mm),淋洗液为15 mmol·L^-1氢氧化钾溶液，检测器为电导检测器。结果:不同生产企业的复方甘草酸铵注射液中，甘氨酸含量均符合标准规定；盐酸半胱氨酸含量为标示量的76.4%～94.3%,亚硫酸钠为处方量的75.7%～96.1%。结论:本法无需样品前处理且准确度高，可为复方甘草酸铵注射液的质量控制提供参考。不同来源的注射液中甘氨酸稳定性较好；盐酸半胱氨酸含量参差不齐，部分样品含量较低、稳定性较差。运用离子色谱法测定亚硫酸钠含量稳定性...     

长期阶梯减量地塞米松联合阿托伐他汀应用于慢性硬膜下血肿术后的疗效研究

目的 探讨长期阶梯减量地塞米松联合阿托伐他汀应用于慢性硬膜下血肿术后的疗效。方法 选取行慢性硬膜下血肿（CSDH）钻孔治疗80例患者为研究对象，按照随机分组法分为对照组和治疗组各40例。对照组术后行常规抗生素预防感染及止血、适量营养补液促进脑膨胀、维持水电解质平衡等对症治疗。治疗组在对照组基础上行长期阶梯减量地塞米松联合阿托伐他汀治疗，比较两组改良Rankin量表（mRS）评分、血肿复发率、并发症发生率及生活能力评分。结果 治疗前，两组mRS评分无明显差异（P>0.05），治疗后均降低，且治疗组低于对照组（P<0.05）；治疗组血肿复发率和并发症发生率均低于对照组（P<0.05）；治疗前两组生活能力评分无明显变化（P>0.05），治疗后BI评分均上升，且治疗组高于对照组（P<0.05）。结论 长期阶梯减量地塞米松联合阿托伐他汀应用于慢性硬膜下血肿术后可有效降低患者血肿复发率，改善患者生活质量，修复患者神经系统功能，减少并发症的产生。