突变型p53蛋白DNA适配子的体外筛选与鉴定

目的 建立体外获得突变型p53蛋白DNA适配子(aptamers)的方法,为该适配子在肿瘤早期诊断及靶向治疗运用中奠定基础.方法 构建长度为75 nt的初始随机单链DNA库,其两端为固定序列,中间为35个随机序列,库容量为1 × 1017～1×1018,以溴化氰活化的琼脂糖小球为筛选介质,运用指数富集的配体系统进化技术(SELEX技术)经逐轮筛选获得突变型p53蛋白的DNA适配子.将适配子库克隆、测序,采用DNAMAN软件对其结构进行分析,通过生物素-亲和素-辣根过氧化物酶显色系统测定适配子与突变型p53蛋白的亲和力.结果 经逐轮筛选,所得适配子富集库与突变型p53蛋白的亲和力逐步提高,A450值从0.1357增加到了0.6818,其亲和力至第8轮筛选达最高水平后进入平台期.克隆第8轮筛选适配子库,测定23个克隆子的序列,其中20个克隆子的序列与预期相符.DNAMAN5.29软件分析表明,20个克隆子的一级序列同源率为76.51%,无共同保守序列,适配子的二级结构则以茎环、凸环结构为主.结论 经8轮筛选获得的DNA适配子与突变型p53蛋白的体外结合具有高度的特异性及亲和力,其克隆子无共同保守序列,适配子的高亲和性与其形成的茎环、凸环等空间结构密切相关.

Abstract：

Objective To set up a method to obtain single-stranded DNA aptamers of mutant p53 protein in vitro by SELEX technique and lay a foundation of application of these aptamers to carcinoma in early diagnosis and targeted therapy. Methods The initial length of 75 bp random single-stranded DNA library was constructedin vitro, both ends had a fixed sequence and there were 35 nucleotides in the middle of random sequence, with capacities of about 1×1017-1×1018. By means of cyanogen bromide (CNBr)activated agarose beads as screening medium, the ssDNA aptamers of mutant p53 protein were selected by SELEX technique. The aptamers were cloned and sequenced, and DNAMAN package was employed to analyze the conserved equences and the second structure of the aptamers. The affinity of aptamers to mutant p53 protein was determined by chromatic biotin-streptavidin-horseradish peroxides system. Results Through screening aptamers round by round, the affinity of aptamers to mutant p53 protein was increased gradually(the A450 values were increased from 0.1357 to 0.6818) and the affinity of aptamers at the round 8 was the highest, and then maintained at the prateau. Twenty out of 23 aptamers had the correct length and fixed sequence after cloning and sequencing. The DNAMAN5.29 sofeware analysis revealed that, the identity of 20 clones was 76. 51% without common conserved sequence and the second structure of the aptamers was stem-loop-based and bulge-based. Conclusion After selection of 8 rounds, the ssDNA aptamers we obtained had high specificity and affinity to mutant p53 protein in vitro and didn't have common conserved sequence. Stem-loops and bulge were the basis of aptamers binding to mutant p53 protein.     

妊高征合并可逆性后部白质脑病综合征28例漏误诊分析

可逆性后部白质脑病综合征(RPLS)是近年来才受到关注的少见病变.妊高征是诱发RPLS最重要的基础病之一,两者合并存在更增加了该病漏误诊的概率.收集2000～2010年间,妊高征合并RPLS漏误诊病例28例,报告如下.     

弓形虫感染对男性精液质量的影响

目的探讨弓形虫感染对男性精液质量的影响。方法应用伟力彩色精子质量分析系统对86例弓形虫感染的不育男性和64例正常生育男性精液的精液量、液化时间、精子总数、精子密度、精子活力、精子活率等参数进行分析。结果正常男性组与弓形虫感染男性组精液的精液量、液化时间、精子总数两组无明显差异（P〉0.05）;精子密度、a级精子百分率、a＋b级精子百分率、精子活率两组差异有显著性（P〈0.05-0.01）。结论弓形虫感染可引起男性精液质量异常,为阐明弓形虫感染引起男性不育的机制提供了科学依据。     

方法验证数据集的应用探讨

目的:充分挖掘方法验证的数据集,为方法后期的广泛应用提供更多参考依据。方法:利用严谨设计的方法验证所得数据集,通过对数据集中各方差分量的拆分或组合,构建日常实践中方法应用所需的评价依据或标准。结果:通过验证实验数据集的不同方差分量的拆分和组合,可形成3个应用评价指标或标准：(1)方法操作模式的变异度(FV);(2)报告值的区分阈值(RVDT);(3)实验室能力评定标准差(σ_PT)。除此之外,还可利用验证数据集中影响因素的限制性最大似然(REML)方差分量值来辨识影响方法的主要因素,为实验操作的改进提供预判方向。结论:在方法验证过程中,使用科学严谨的验证实验设计所得的数据集,不仅可保证方法自身性能和方法检测能力的可靠评价,还可推导出更多有重要实践意义的应用评价标准,并对方法特性有更全面的了解。本文所论述指标,不仅适合于生物活性检测方法,也适合于理化方法。     

苗药血人参提取物对衰老小鼠学习能力的影响

目的:探讨血人参提取物对衰老小鼠学习能力的影响及其可能的作用机制。方法:制备衰老小鼠模型,将其分为正常对照组、模型组、阳性对照组(脑复康0.8 g·kg~(-1)·d~(-1))、血人参高、中、低剂量组(20 g·kg~(-1)·d~(-1)、10 g·kg~(-1)·d~(-1)、5 g·kg~(-1)·d~(-1)),观察血人参提取物对衰老小鼠体重变化的影响和学习能力的影响。采用ELISA法检测衰老小鼠血清中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的含量。结果:与模型组比较,从第2周开始,血人参高、中、低剂量组体重出现明显增加(P0.05);中、低剂量组小鼠学习能力显著提高(P0.05);与模型组比较,血人参高、中、低剂量组血清中GSH-Px含量显著升高(P0.01)。结论:血人参提取物抗衰老效果明显,能显著提高衰老小鼠的抗氧化能力和学习能力。     

脑苷肌肽联合多奈哌齐治疗阿尔茨海默病的疗效观察

目的探讨脑苷肌肽联合多奈哌齐治疗阿尔茨海默病的临床疗效。方法选取2011年3月—2015年3月巴彦淖尔市医院神经康复科收治的阿尔茨海默病患者114例,随机分为对照组(65例)和治疗组(49例)。对照组患者每晚口服盐酸多奈哌齐片,初始剂量5 mg/d,1个月后增至终剂量10 mg/d。治疗组在对照组的基础上于治疗前2周静脉滴注脑苷肌肽注射液,10 m L加入生理盐水250 m L中,1次/d。所有患者均连续治疗6个月。比较两组患者临床疗效,评估两组患者治疗前后简易智力状态检查量表(MMSE)、蒙特利尔认知评定量表(Mo CA)、日常生活能力量表(ADL)、汉密尔顿焦虑量表(HAMA)和汉密尔顿抑郁量表(HAMD)评分。结果治疗后,对照组和治疗组总有效率分别为87.7%和93.9%,两组总有效率比较差异无统计学意义。治疗后,两组患者MMSE和Mo CA评分较治疗前明显升高,HAMA和HAMD评分则显著下降,且治疗组ADL评分较治疗前显著升高,同组治疗前后MMSE、Mo CA、HAMA和HAMD评分及治疗组ADL评分治疗前后比较差异具有统计学意义(P0.05)。治疗后,治疗组MMSE、Mo CA、ADL和HAMD评分比对照组治疗后改善更显著,两组比较差异具有统计学意义(P0.05)。结论脑苷肌肽联合多奈哌齐治疗可改善阿尔茨海默病患者的认知功能、日常生活能力和焦虑抑郁情绪。     

临床路径护理对子宫肌瘤手术患者焦虑情绪及应激反应的影响

目的 分析临床路径护理对子宫肌瘤手术患者焦虑情绪及应激反应的影响。方法 选取2017年5月—2019年2月本院收治的子宫肌瘤手术患者86例,以随机数字表法分组,两组均43例。对照组提供常规护理,观察组实施临床路径护理。比较两组患者心理状态与应激反应。结果 干预后观察组SAS、SDS评分[(41.24±5.24)分、(43.24±5.51)分]均比对照组[(49.72±7.33)分、(50.64±7.87)分]低,差异有统计学意义(t=6.172、5.051,P值均<0.001);术毕时观察组去甲肾上腺素、肾上腺素及皮质醇水平[(251.62±27.44)ng/L、(128.36±19.57)ng/L、(117.97±13.58)ng/L]均比对照组[(330.10±32.37)ng/L、(144.87±21.14)ng/L、(134.87±14.84)ng/L]低,差异有统计学意义(t=12.127、3.758、5.509,P值均<0.001)。结论 运用临床路径护理可有效改善患者焦虑、抑郁等心理,减少应激反应。     

基于计算机辅助设计的竹节参总皂苷改善HepG2细胞脂质代谢的作用及机制研究

目的研究竹节参总皂苷(TSPJ)改善人肝癌HepG2细胞脂质代谢的作用,基于计算机辅助药物设计,预测并验证TSPJ可能的作用靶点。方法应用棕榈酸(PA)诱导HepG2细胞脂肪变性模型,实验分为对照组、模型组、TSPJ(50.0、25.0、12.5 mg/L)组。5组细胞均培养24 h后,分别采用油红O染色和尼罗红染色定性、定量检测细胞内脂质积累情况;采用试剂盒检测细胞内三酰甘油(TG)的含量;采用计算机辅助药物设计预测TSPJ可能的作用靶点,用免疫荧光检测相关蛋白的表达。结果 PA浓度为100μmol/L处理细胞24 h可以造成HepG2细胞脂质积累模型,TSPJ可以显著改善HepG2细胞脂质积累(P0.01),降低TG含量;利用计算机辅助药物设计预测TSPJ的作用靶点可能是雌激素相关受体;与对照组比较,模型组雌激素β受体(ERβ)表达水平降低,与模型组比较,用药组ERβ表达水平均升高。结论 TSPJ可以显著改善HepG2细胞脂质代谢,其作用靶点可能是ERβ。     

电针“足三里”穴对内脏痛大鼠延髓内脏带内c-fos和GFAP表达的影响

目的:探讨电针对内脏痛大鼠模型疼痛行为学方面的影响以及延髓内脏带中即刻早期基因c-fos和胶质原纤维酸性蛋白(Glial Fibrillary Acidic Protein,GFAP)在针刺镇痛中的表达及其意义。方法:雄性SD大鼠32只,随机分为空白对照组、内脏痛组、电针组和电针后内脏痛组,每组8只。将0·6%乙酸(V/V,10mL/kg)注射入大鼠腹腔内造成内脏痛模型。电针取双侧“足三里”穴,断续波,频率50Hz,强度2~5V,持续30min。观察并计算各组动物的疼痛指数(visceral painindex,VPI)后处死动物,延髓切片进行抗Fos蛋白或抗GFAP单一或双重标记的免疫组织化学染色,观察并记数c-fos和GFAP在中枢延髓内脏带内的表达。结果:内脏痛组和电针后内脏痛组出现典型的扭体反应,其中内脏痛组更明显,而空白对照组和电针组大鼠行为学无变化。各组c-fos阳性神经元、GFAP阳性星形胶质细胞表达主要位于延髓内脏带内孤束核、迷走神经背侧运动核。除了空白对照组,内脏痛组、电针组和电针后内脏痛组中c-fos和GFAP表达明显增高;3组之间比较,c-fos和GFAP表达内脏痛组最高,电针后内脏痛组其次,电针组最低(P<0·01)。结论:电针“足三里”穴对内脏痛模型大鼠的疼痛具有良性调节作用,其机制可能与其调节延髓内脏带内免疫阳性神经元和星形胶质细胞的功能活动有关。