小鼠原始生精细胞裸鼠皮下移植动物模型的制作

目的制作睾丸组织异体异位移植动物模型,并观察原始生精细胞在异体异位继续生长、发育情况。方法将鼠龄为1～2d昆明小鼠睾丸组织移植至去势裸鼠背部(n=29),于移植后30～110d取出移植物,观察移植物的生长情况、表观形状以及各级生精细胞、生精上皮发育的期相情况。结果术后29只受鼠全部存活,在其背部均观察到移植物的生长,移植物直径由移植前的(0.73±0.05)mm增加到(6.75±0.73)mm,湿重由移植前(5.67±0.72)mg增加到(113.12±78.23)mg,受鼠皮肤血管已广泛深入到移植物内;光镜下可见移植物中生精小管结构清晰,移植物与受鼠皮肤之间建立了紧密连接,移植物中含有各级生精细胞及精子,在过碘酸Schiff(PAS)染色的移植物标本可见整个精子发生周期(从StageⅠ到StageⅫ)各阶段的生精细胞。结论新生小鼠睾丸组织移植到去势裸鼠背部能够继续生长、发育,可作为研究生精细胞增殖发育规律和精子发生调控机制的动物模型。     

大鼠肺癌癌变过程中癌组织内微血管的定量研究

目的:研究大鼠肺癌癌变过程中癌组织内血管生成量的变化。方法:采用针对第Ⅷ因子相关抗原的免疫组织化学方法,对56例大鼠肺癌组织内微血管进行染色,并用图像分析系统定量。结果:肺癌癌变过程中早期浸润癌及浸润癌组织内可见明显的血管形成,早期癌及浸润癌血管生成量分别为(256.1±81.7)μm2、(548.4±175.1)μm2,早期癌血管生成量明显低于浸润癌,差异有显著性(P<0.01)。结论:肿瘤血管化程度增高与肿瘤的浸润密切相关,图像分析系统进行肿瘤血管定量具有客观、快速、方便的优点。     

人子宫内膜基质细胞的体外蜕膜化及其与腺体细胞的关系

体外分离、培养人子宫内膜基质细胞和腺体细胞,待基质细胞生长融合后,加入孕酮刺激,使其蜕膜化。结果显示,孕酮（ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ,Ｐ）组基质细胞胞体变大、变圆,尤以含胎牛血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ,ＦＢＳ）组显著。用酶免疫分析法检测培养液中催乳素（ｐｒｏ－ｌａｃｔｉｎ,ＰＲＬ）含量发现,培养ｄ１７～２０ＰＲＬ分泌量达到高峰;免疫细胞化学染色可见基质细胞ＰＲＬ免疫反应阳性。在此基础上,将同期培养的腺细胞匀浆液加入到已蜕膜化的基质细胞中,结果发现,在加入腺体匀浆液３ｄ后蜕膜细胞胞体变小,ＰＲＬ分泌量减少,而对照组的ＰＲＬ产量则递增。结果提示,子宫内膜腺细胞对蜕膜反应有一定的抑制作用,其作用方式和机制有待于进一步探讨。     

血管内皮生长因子体外诱导大鼠骨髓基质细胞分化为神经元样细胞

目的：本实验探讨血管内皮生长因子对骨髓基质细胞在体外向神经细胞分化的作用。旨在为临床使用BMSCs移植和神经保护剂治疗脑损伤提供实验基础。 方法: 采用青年SD大鼠的全骨髓细胞进行培养。传至第3代时,流式细胞分析鉴定骨髓基质细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）表面标志物CD90和CD45。经10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor,b-FGF）预诱导24h后,用含不同浓度血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor ,VEGF）的诱导液进行诱导。细胞分为4组：A～C组分别加入浓度为5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml VEGF的诱导液;D组作为对照组,不加VEGF。倒置相差显微镜（×200）下逐日观察细胞形态变化,诱导后的第3天和第10天分别计数每20个随机视野下神经细胞样形态的细胞总数。采用免疫组织化学方法鉴定神经细胞标志蛋白神经烯醇化酶（neuron specific enolase,NSE）。 结果: 流式细胞分析结果示P3代BMSCs细胞表面CD90(＋)CD45(－)。诱导第3天A~C组均有细胞出现胞体回缩,呈锥形或圆形,胞体折光性增强,伸出较细长单级或多极突起,并分出次级突起,诱导第10天,A~C组发生以上形态改变的细胞数目较前增多,D组中也有个别细胞出现以上形态改变。B组中的神经元样细胞数目最多,与A组、C组及D组比较,差异有统计学意义（P<0.05）;D组中神经元样细胞数目最少,与A组、B组及C组比较差异有统计学意义（P<0.05）。第10天各组神经元样细胞数目均较第3天增多,各组第3天和第10天神经元样细胞数目相比较差异有统计学意义（P<0.05）。免疫组织化学证实具有神经元样形态的细胞表达NSE。 结论:在本实验条件下,VEGF能促进骨髓基质细胞体外向神经元样细胞分化,本实验预设的VEGF的3个浓度中,10ng/ml为最合适的浓度。     

诱导分化后的人造血干细胞移植裸鼠肝脏后HSA、白蛋白的表达

目的 了解经体外生长因子诱导分化的人造血干细胞移植裸鼠肝脏后,其向肝细胞分化的变化情况.方法 ①在人造血干细胞培养过程中加入肝细胞生长因子(HGF)、成纤维生长因子4(FGF4)即A液,并于培养后8、16天ELISA检测培养液上清中白蛋白(ALB)的质量浓度;对照组不加FGF4、HGF(B液).②对36只裸鼠实施70%肝切除术后将人造血干细胞移植至裸鼠脾被膜下,实验组(20只)使用A液,对照组(16只)使用B液;于术后第3、5、9天分批处死裸鼠,获取肝脏组织进行免疫组化显色检测.结果 ①A液中0、8、16天的ALB值差异明显,且ALB的表达随培养时间延长而逐渐升高.B液中0、8、16天的ALB值差异无显著性.A液、B液8、16天时间点的ALB值有极显著性差异(P＜0.01).②术后48 h存活的实验组和对照组裸鼠肝脏组织标本可见人肝细胞特异性抗原(HSA)、ALB的表达.实验组总的表达率(显色率)为88.9%,对照组为33.3%,两者比较差异有显著性(P＜0.05).上述表达存在于门脉区、血窦旁.结论 ①裸鼠肝脏内存在人原性细胞,且已分化成为人肝实质细胞.②在裸鼠肝脏内存在不同分化期的肝细胞样细胞.③在有肝损伤的裸鼠体内,输注入经过培养、扩增和诱导分化后的人造血干细胞,可以提高其向肝细胞的分化率.     

受体激素水平对未成熟睾丸移植物中生精细胞的生长发育影响

目的 采用已建立的未成熟睾丸组织异体异位移植模型,研究受体小鼠激素水平变化对未成熟睾丸组织移植物生长发育的影响.方法 以免疫缺陷小鼠为受体,将新生1～2d龄昆明小鼠睾丸移植到受体小鼠背部皮下.在移植后不同阶段取出移植物,进行组织形态学观察,分析移植物中生精细胞的发育情况,同时采用放射免疫分析法检测受体动物血清中睾酮(T)、促卵泡刺激素(FSH)和促黄体生成素(LH)水平,并以同龄正常昆明小鼠作对照.结果 受体小鼠血清中LH水平没有明显波动,而T和FSH浓度在移植的前8周呈逐渐上升趋势,从9周以后开始下降,且显著低于正常受体内睾酮和FSH浓度,与组织学中所观察到的生精上皮受损程度的增加是同步的.结论 以上结果提示,应注意获取移植物中精子的最佳时间.对于小鼠来说,从新生小鼠睾丸移植物中获取精子的最佳时间是术后5-8周.     

5氮杂脱氧胞苷对鼻咽癌细胞RASSF1A基因甲基化和mRNA表达的影响

目的:研究5氮杂脱氧胞苷对鼻咽癌CNE2细胞中RASSF1A基因甲基化和mRNA表达的影响。方法:用不同浓度(0、5、10、20μmol/L)5氮杂脱氧胞苷处理CNE2细胞,采用甲基化特异性PCR(MSP)法对处理后细胞中RASSF1A基因甲基化状态进行检测;并用SYBR Green qReal Time-PCR法检测RASSF1A mRNA的表达。结果:阴性对照组CNE2细胞中,RASSF1A基因呈完全甲基化状态,当用5μmol/L 5氮杂脱氧胞苷处理后,CNE2细胞出现非甲基化产物,20μmol/L 5氮杂脱氧胞苷处理后,CNE2细胞甲基化状态完全被逆转,均为非甲基化产物。阴性对照组CNE2细胞RASSF1A基因呈低表达,经5～20μmol/L 5氮杂脱氧胞苷处理后,RASSF1A mRNA的相对表达量逐渐增加,10和20μmol/L 5氮杂脱氧胞苷处理组,RASSF1A mRNA表达水平均明显高于阴性对照组(P0.01);且20μmol/L处理组明显高于5μmol/L处理组(P0.01)。结论:CNE2细胞RASSF1A基因甲基化可以被5氮杂脱氧胞苷逆转,且5氮杂脱氧胞苷可促进RASSF1A mRNA的表达。     

人子宫内膜基质细胞和腺体细胞的分离培养及鉴定

目的：人子宫内膜分离培工得到纯度较高的内膜基质细胞和腺体细胞。方法：采用二次滤网过滤法进行分离并通过光镜观察和免疫细胞化学染色对其进行鉴别。结果：基质细胞在接种后0．5h开始贴壁,可见梭形和多角形两种形态的细胞。免疫细胞化学染色显示这两种细胞均具有波形蛋白免疫反应,反应率可达95％以上,而细胞角蛋白无免疫反应性,提示它们为来源于内膜基质的基质细胞,大部分腺体细胞在接种24h后贴壁,培养后4d左右腺体细胞呈旋涡状排列,单个细胞为多角形,核大而圆,腺细胞呈细胞角蛋白反应性,反应率在90％以上,结论：采用二次滤网过滤法可成功地分离入人子宫内膜基质细胞和腺体细胞。     

人TGF-β2特异性siRNA质粒的构建

目的:构建人TGF-β2特异性siRNA质粒。方法:从NCBI中查找人TGF-β2的mRNA序列,并利用生物信息学对序列进行分析;根据siRNA的设计原则,选择最佳的siRNA序列;利用限制性内切酶BamHⅠ和BbsⅠ将相应的双链DNA插入到GPU6/GFP/Neo载体中;重组质粒经限制性内切酶BamHⅠ和PstⅠ单酶切进行鉴定,鉴定正确的质粒进一步通过基因测序的方法进行验证。结果:根据生物信息学选择TGF-β2mRNA的1016～1034区域作为干扰位点;重组质粒酶切结果表明双链DNA序列成功插入到了GPU6/GFP/Neo载体中;测序分析结果进一步证明插入序列与设计完全一致。结论:成功构建了人TGF-β2特异性siRNA干扰质粒,为研究TGF-β2基因功能和利用基因治疗的方法提高青光眼滤过手术成功率奠定了实验基础。     

晚期激活抗原-4在CD34+造血干/祖细胞宫内移植早期归巢中的作用

目的 探讨黏附分子晚期激活抗原-4(VLA-4)在脐血CD34+造血干/祖细胞小鼠宫内移植早期归巢中的作用.方法 用密度剃度离心的方法分离脐血CD34+细胞,经SCF和Il-6扩增24h,在BALB/c母鼠怀孕第15天经胎鼠腹腔注射CD34+细胞,每只胎鼠约注射1×105个细胞.用PKH26标记细胞的方法追踪早期归巢情况.在VLA-4阻断实验中,CD34+细胞注射前用20μg/ml抗VLA-4单抗孵育30 min.分别于注射后48h用流式细胞仪检测小鼠胎肝细胞中的人CD45+细胞.结果 SCF+IL-6扩增后脐血CD34+细胞VLA-4表达由原来的(26.34±5.37)%增高至(65.67±8.72)%(P＜0.01).扩增的细胞经胎鼠腹腔移植48h后,在胎肝中可以见到PKH26标记的CD34+细胞,流式细胞仪检测胎肝中人CD45+细胞百分率为(26.54±9.56)%.CD34+细胞移植前经抗VLA-4单抗预处理后胎肝中人CD45+细胞检出率显著降低(3.57±1.25)%,P＜0.01.结论 VLA-4对CD34+造血干/祖细胞宫内移植早期归巢有重要作用.