抗人CD86单链抗体的基因克隆、表达及结合活性分析

目的 构建并在CHO细胞中表达抗人CD86单链抗体(CD86-scFv),研究该抗体与抗原的结合特性及介导的生物学功能.方法 从分泌鼠源CD86抗体的杂交瘤细胞中克隆出VH和VL基因,构建含有前导肽L-VH-Linker-VL抗体编码基因的表达载体并转染CHO细胞.经筛选高分泌株并扩大培养后收集上清进行纯化.流式细胞术分析CD86-scFv对不同细胞膜型CD86分子的识别及与鼠源亲本抗体1D1的竞争抑制效应.MTT法分析CD86-scFv与Raji细胞表达的CD86结合后对细胞生长的影响.结果 获得了稳定表达抗人CD86-scFv的CHO细胞株及相应抗体.CD86-scFv与CD86基因转染细胞株L929-CD86、天然表达CD86分子的人B系淋巴瘤细胞Raji和Daudi细胞的阳性结合率分别为67.0％、72.3％和80.5％.CD86-scFv对鼠源亲本抗体1D1具有竞争结合能力,将CD86-scFv(终浓度20μg/mL)加入Raji细胞共同培养72 h时的细胞生长抑制率为28.3％.结论 成功构建了稳定分泌抗人CD86-scFv的CHO细胞株(命名为SA-IV).该抗体能够识别CD86分子并具有良好的生物学活性.     

脑脊液生物标志物在阿尔茨海默病与非痴呆神经疾病间的浓度比较

目的观察脑脊液淀粉样蛋白和总tau（t-tau）蛋白、磷酸tau（p-tau）蛋白等生物标志物在阿尔茨海默病（alzheimer’s disease,AD）患者和非痴呆神经疾病患者中的鉴别诊断作用。方法采用ELISA方法检测12例AD患者和22例非痴呆神经疾病患者脑脊液标本中淀粉样蛋白Aβ（1-40）、Aβ（1-42）、t-tau蛋白、p-tau蛋白的浓度水平。结果与AD患者相比,非痴呆神经疾病患者Aβ（1-42）、t-tau水平增高,Aβ（1-40）、p-tau水平降低。在诊断效果上,Aβ（1-40）、总tau蛋白曲线下面积较大,特异性、灵敏度均大于80%。与另一实验室结果比较,p-tau在两个实验室的检测结果相关性较好（R2=0.950）。结论 Aβ（1-40）和t-tau在AD组与非痴呆神经疾病组之间差异具有统计学意义,可用于两组间的鉴别诊断。P-tau检测方法稳定,实验室间重复性良好,适于临床开展。     

全硫代反义寡核苷酸对脑胶质瘤细胞端粒酶活性作用

目的本研究采用针对人端粒酶hTR基因的反义寡聚脱氧核苷酸,探讨端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸(antisense oligodeoxy nucleotides,ASODN)对脑胶质瘤HO-8910细胞端粒酶活性及细胞增殖的影响。方法本实验将互补于hTR模板区的全硫代修饰型反义寡核苷酸(PS-ASODN)经lipotap脂质体转染作用于脑胶质瘤细胞系C6,然后分别采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色实验、酶联免疫吸附试验(ELISA)法和流式细胞术检测C6脑胶质瘤细胞的体外增殖、端粒酶活性、细胞凋亡和细胞周期的改变。结果经MTT法检测,PS-ASODN对C6细胞生长具有明显的抑制作用和诱导细胞凋亡,1.0μMPS-ASODN处理后24h细胞生长抑制率为12.93%,且随着时间的延长,抑制作用逐渐增强;给药72h对细胞生长抑制率达到最高,为50.81%,有相应的浓度依赖关系。ELISA法检测结果 ,0.5～1.5μM的PS-ASODN对C6细胞作用72h后端粒酶皆为阴性,表明PS-ASODN能够抑制端粒酶活性,对照组端粒酶皆为阳性。结论端粒酶PS-ASODN对体外培养的脑胶质瘤C6细胞的增殖有明显的浓度、时间依赖性抑制作用;抑制脑胶质瘤C6的端粒酶活性和诱导C6脑胶质瘤细胞发生凋亡,可能是端粒酶PS-ASODN抑制C6细胞增殖的主要机制。     

过表达ODC抑制氧化应激诱导大鼠心肌细胞凋亡的研究

目的构建过表达鸟氨酸脱羧酶（ODC）基因慢病毒载体,并研究其对氧化应激诱导大鼠H9C2心肌细胞凋亡的影响。方法构建大鼠ODC基因pHIV-ODC过表达质粒,与包装质粒psPAX2、pMD2G共转染293FT细胞,检测其侵染效率;包装慢病毒并侵染H9C2心肌细胞;72 h后观察其侵染效率,RT-PCR法检测细胞ODC mRNA的表达,利用CCK-8、Hochest33258染色检测ODC对H2O2诱导H9C2心肌细胞凋亡的影响。结果酶切及测序鉴定ODC序列正确插入慢病毒过表达载体。侵染H9C2细胞72 h后ODC mRNA水平较阴性慢病毒感染组显著升高。过表达ODC能抑制H2O2诱导的细胞活力下降,减轻H2O2诱导的心肌细胞凋亡,与H2O2组比较差异均有统计学意义（P〈0.001）。结论成功构建的过表达ODC慢病毒,上调H9C2细胞中ODC的表达,过表达ODC能显著抑制氧化应激诱导的H9C2心肌细胞凋亡。     

肿瘤细胞表面TLR在促肿瘤发展中的作用和机制

自Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)发现以来,大量的研究主要集中于TLRs在天然免疫反应和调节适应性免疫中发挥的作用和机制。然而,近年来发现,除了表达于免疫系统的各种细胞外,TLRs还表达于肿瘤细胞表面,于是人们对肿瘤细胞TLRs在促进肿瘤发展中的作用和机制进行了探讨,发现TLRs能通过免疫逃避,以及促进肿瘤细胞存活、增殖和迁移等机制促进肿瘤发生和发展。因此,本文就肿瘤细胞上TLR在促进肿瘤中所发挥的作用及其机制进行综述。     

12例多种羧化酶缺乏症的基因突变分析

目的 旨在从基因水平证实多种羧化酶缺乏症(multiple carboxylase deficiency,MCD)的诊断,探讨我国MCD患儿的基因突变情况.方法 12例MCD患儿接受基因诊断.采用PCR及直接测序法分别对4例生物素酶(biotinidase,BT)缺乏症和8例全羧化酶合成酶(holocarboxylase synthetas,HLCS)缺乏症进行BT基因和HLCS基因突变分析,对基因新突变通过限制性片段长度多态性分析及患儿父母和50名正常对照者基因检测以证实.结果 12例患儿基因突变检出率100%.4例BT缺乏症中发现BT基因突变6种:c.98-104del7ins3,c.1369G>A(V457M),c.1157G>A(W386X),c.1284C>A(Y428X),c.1384delA,c.1493_1494insT,后4种为新突变.8例HLCS缺乏症中发现HLCS基因突变4种:c.126G>T(E42D),c.1994G>C(R665P),c.1088T>A(V363D),c.1522C>T(R508W),后两种为热点突变[75%(12/16)],c.1994G>C为新突变.结论 本研究从基因水平上证实了12例MCD的诊断.共发现了6种BT基因突变,4种HLCS基因突变,其中5种为新突变;得出2种HLCS基因的热点突变.     

威斯康星卡片分类测验作为双生子基因功能稳定性指标的初探

目的：探索威斯康星卡片分类测验测试各指标中更稳定、更精确的指标（内表型）。方法：在重庆市主城区募集6—16岁的双生子。签写知情同意书后，用威斯康星卡片分类测验对59对6—16岁的双生子测试（同卵双生28对，异卵双生31对），比较双生子两个体之间的六个常用指标（正确数、错误数、持续错误数、非持续错误数、总分类数、完成第一个分类所需个数）得分的相关系数，采取双生子的颊黏膜标本以提取DNA并进行卵型鉴定。结果：MZ组和DZ组的年龄、性别、受教育年限具有可比性（P〉0．05），MZ组的持续错误数指标在双生子对个体之间的相关系数有显著相关（r=0．65，P=0．001），其余五个指标和DZ组的六个指标在双生子对个体之间的得分无显著性相关（P〉0．05）。结论：在威斯康星卡片分类测验常用的六个指标中，持续错误数受遗传的影响更大，作为内表型指标可能优于威斯康星卡片分类测验中的其他指标。     

抗人CD40人-鼠嵌合抗体在CHO细胞中的表达及其功能研究

目的:实现抗人CD40的人-鼠嵌合抗体(ch-5C11)在的CHO细胞中的稳定表达并对其生物学活性进行初步的研究。方法:pIRES/hu5C11嵌合抗体重组表达质粒用脂质体法转染CHO细胞,采用RT-PCR对CHO细胞进行基因水平鉴定,以流式细胞术(FCM)和Western blot对表达上清中ch-5C11人免疫球蛋白Fc段和κ链成分进行检测,利用Protein G亲和层析和Lowry法进行纯化和定量,MTT实验检测表达ch-5C11对Daudi细胞增殖的抑制效应。结果:获得稳定分泌目的蛋白的CHO稳定株,RT-PCR结果表明目的基因成功整合在CHO稳定株中,FCM和Western blot结果表明稳定株上清中含有抗人CD40抗体,且含人免疫球蛋白Fc段和κ链;Lowry法定量ch-5C11浓度为0.535mg/L,并经SDS-PAGE蛋白电泳鉴定纯度良好;ch-5C11能抑制Daudi细胞增殖。结论:获得了持续分泌ch-5C11的CHO稳定株,功能学研究显示ch-5C11能抑制B细胞淋巴瘤细胞株体外增殖。     

重组蛇毒纤溶因子rFⅡ偶联到聚氨酯表面及其纤溶活性评价

目的：通过聚氨酯表面偶联重组蛇毒纤溶因子rF Ⅱ来提高其纤溶活性。方法：在聚氨酯（PU）表面上涂覆含羧基硬段的聚氨酯溶液（PU1）制备羧基化表面聚氨酯（CPU）,并用次甲基蓝吸附法测定表面羧基含量;在CPU表面上用EDC接枝双端氨基聚乙二醇（PEG）,并用滴定法测定该表面的PEG接枝量;在CPU-PEG表面用EDC偶联重组蛇毒纤溶因子（rF Ⅱ）,并用放射性同位素法测定该表面的rF Ⅱ偶联量,最后用试管定量法评价样品的纤溶活性。结果：CPU表面羧基含量为6.9μmol/cm^2,CPU-PEG2k和CPU-PEG4k表面PEG含量分别为0.162和0.180μmol/cm^2,CPU-PEG2k-^125Ⅰ-rFⅡ和CPU-PEG4k^125Ⅰ-rFⅡ表面rF Ⅱ含量分别为13.6和38.9ng/cm^2,与对照样品相比都有很大的提高。纤溶活性评价表明,所有偶联rF Ⅱ样品的纤溶活性都有提高,抗血栓性能得到有效改善。结论：具有PEG间隔臂偶联rF Ⅱ的样品其纤溶活性比没有PEG间隔臂的样品更优,采用PEG4k间隔臂偶联rF Ⅱ样品的纤溶活性为最高。