中药制剂承载丸对甲基强的松龙预处理的成骨细胞L型钙通道电流的影响

目的:观察承载丸含药血清对甲基强的松龙预处理的MC3T3-E1成骨细胞L-钙通道电流的影响。方法:实验于2006-04/06在中国中医科学院望京医院药理实验室及吉林大学基础医学院生理教研室完成。①实验材料:MC3T3-E1(购于北京协和细胞中心);8个月龄SD大鼠10只,雌雄各半;中药制剂承载丸(由鹿角霜、肉苁蓉、续断、黄芪、当归、炙水蛭、杜仲、蛋衣、皂角刺、香附、乌药等21味中药组成);甲基强的松龙(批号H20040338,Pharmacia NV/SA生产)。②实验干预:成骨细胞(MC3T3-E1)传代培养。承载丸药粉60g,加水至200mL搅匀,取大鼠6只(雌雄各半),每只灌服2.5mL/d,灌服4d后动脉取血,制备含药血清。另取大鼠4只,同法灌服生理盐水,制成不含药血清。甲基强的松龙的浓度为1×10-5mol/L。③实验分组:将培养后的成骨细胞株分为4组:正常组(加入正常大鼠不含药血清)、模型组(加入正常大鼠不含药血清及甲基强的松龙)、承载丸低剂量组(加入甲基强的松龙及0.5mL承载丸含药血清)和承载丸高剂量组(加入甲基强的松龙及0.1mL承载丸含药血清)。④实验评估:24h后,用全细胞膜片钳技术记录每组10个细胞的L-钙通道电流,并测定其峰值电流。结果:①各组电流峰值测定结果:模型组峰值电流比正常组下降19.5%[(0.1839±0.0179),(0.2284±0.0209)nA,P<0.01];承载丸低剂量组和高剂量组比模型组分别升高37.4%和45.2%[(0.2526±0.0093),(0.2671±0.0120),(0.1839±0.0179)nA,P<0.01];承载丸高低剂量组相比差异有显著性意义(P<0.05)。②MG3T3E1细胞钙电流的特性分析:正常组,钙通道大约在-20mV时开放,最大峰值电流在 20～ 30mV,反转电位在 60～ 70mV。当在浴液中加入Co2 ,可阻断此电流的大部分电流成份,其峰值电流为(0.1050±0.0097)nA,而钙离子激活剂Bayk8644增加了此电流(0.3335±0.0323)nA。结论:①甲基强的松龙抑制成骨细胞L-钙通道电流。②承载丸含药血清可升高甲基强的松龙预处理的成骨细胞L-钙通道电流。     

构建肠系膜微淋巴管内皮细胞培养技术并观察休克淋巴液环境中内皮细胞的形态变化

目的:建立肠系膜微淋巴管内皮细胞的培养技术,观察不同体积分数的休克淋巴液对大鼠肠系膜微淋巴管内皮细胞形态的影响。方法:实验于2004-02/07在河北北方学院病理生理学教研室及实验中心细胞培养室完成。选择健康雄性Wistar大鼠,体质量分别为220～300g和50～80g。实验方法:①无菌条件下制备大鼠重症失血性休克模型,引流肠系膜淋巴液或收集门静脉血;同时另取大鼠,引流正常淋巴液或正常门静脉血。②从动物种类、培养基、植块方法、胎牛血清浓度等方面对植块培养法进行改良,进行肠系膜微淋巴管内皮细胞原代培养并传代。实验分组:分为6组:胎牛血清组:培养液为DMEM 体积分数为0.1的胎牛血清;正常淋巴液组:培养液为DMEM 正常淋巴液;休克淋巴液组:培养液为DMEM 体积分数为0.04,0.06,0.08,0.10的休克淋巴液;正常血浆组:培养液为DMEM 正常血浆;休克血浆组:培养液为DMEM 休克血浆;无血清对照组:培养液为DMEM。实验评估:①光镜下观察大鼠肠系膜微淋巴管内皮细胞原代培养及传代情况。②光镜、扫描电镜及透射电镜下观察不同体积分数的休克淋巴液及不同作用时间(4,8,12h)对肠系膜微淋巴管内皮细胞形态及超微结构的影响。结果:①光镜下肠系膜微淋巴管内皮细胞原代培养及传代情况:内皮细胞呈扁平的梭形或多边形,大小均匀,胞核清晰,呈卵圆形。细胞生长融合形成单层后,呈典型的鹅卵石或铺路石样镶嵌状排列生长。②光镜下在休克淋巴液中肠系膜微淋巴管内皮细胞形态:体积分数为0.04的休克淋巴液作用4h时细胞逐渐收缩、变圆直至脱落漂浮,随着休克淋巴液体积分数增加及作用时间延长,细胞损伤逐渐加重,体积分数为0.08的休克淋巴液作用4h时核旁出现空泡,体积分数为0.10的休克淋巴液作用12h时细胞裂解成碎片。其他各组作用12h肠系膜微淋巴管内皮细胞形态无显著改变。③扫描电镜下在休克淋巴液中肠系膜微淋巴管内皮细胞形态:体积分数为0.04的休克淋巴液作用4h部分细胞逐渐收缩离壁,细胞间隙增大、细胞边缘的突起拉长、缩短、断裂,作用8,12h可见凋亡小体。其他各组作用12h肠系膜微淋巴管内皮细胞形态无显著改变。④透射电镜下在休克淋巴液中肠系膜微淋巴管内皮细胞形态:体积分数为0.04的休克淋巴液作用4h细胞膜形态不规整,胞浆内质网等膜性细胞器扩张,核形态不规则,作用8h线粒体呈球形扩张,细胞核逐渐出现固缩、似细胞凋亡改变,核周腔变宽;体积分数为0.08的休克淋巴液作用时间8h细胞内出现囊泡,内质网不同程度扩张,线粒体主要表现为浓缩、深染等改变,细胞膜边界不清,出现起泡、破碎等现象。其他各组作用12h肠系膜微淋巴管内皮细胞形态无显著改变。结论:成功建立了肠系膜微淋巴管内皮细胞的培养技术;休克淋巴液可导致肠系膜微淋巴管内皮细胞形态及超微结构损伤。     

幼年豚鼠视网膜兴奋毒性损伤模型的建立

目的:观察谷氨酸钠不同给药时程对幼年豚鼠视网膜神经节细胞损伤的程度,以建立简便而稳定可靠的视网膜兴奋毒性损伤模型。方法:实验于2005-03/2006-06在泰山医学院动物实验中心和形态学实验室完成。①实验材料:45～50d(幼年)豚鼠35只,体质量280～320g,雌雄不拘;谷氨酸钠(上海伯奥生物科技有限公司生产),纯度99%,pH6.9～7.2,用生理盐水配成300g/L溶液。②实验分组:采用随机数字法将豚鼠分成2组,即正常对照组5只、谷氨酸钠组30只(谷氨酸钠组根据用药时间又分为4个亚组,即1d组5只、3d组6只、7d组9只,14d组10只)。③实验干预:谷氨酸钠组按3g/kg体质量腹腔注射谷氨酸钠,分别连续1,3,7和14d。④实验评估:给药后,再饲养10d后取材,观察视网膜神经节细胞数目和形态学的变化。结果:①各组豚鼠视网膜光镜观察结果:谷氨酸钠1d组视网膜神经节细胞未见明显形态学改变;3d组少数细胞发生皱缩;7d组视网膜神经节细胞损伤较为明显,多数神经节细胞发生核固缩;14d组动物半数死亡(5/10),视网膜神经节细胞损伤严重,明显脱失,残留细胞体积变小。②各组豚鼠视网膜神经节细胞密度:谷氨酸钠14d组、7d组视网膜神经节细胞密度与正常对照组比较差异均显著(P<0.01),谷氨酸钠3d组与正常对照组比较差别有统计学意义(P<0.05),谷氨酸钠1d组与正常对照组比较差异无显著性(P>0.05)。结论:谷氨酸钠对幼年豚鼠视网膜的毒性损伤与用药时程有关,按3g/kg体质量腹腔注射,1次/d,连续7d,能成功建立谷氨酸视网膜兴奋毒性豚鼠动物模型,且无一例死亡,损伤适中。     

组织工程技术仿生构建颅颌骨组织的研究

目的:探索构建组织工程化仿生骨种植体的方法流程,并制备成骨细胞-可吸收载体种植体样品,同时尝试建立组织工程化非承载骨种植体的评价方法。方法:实验于2001-05/2005-12分别在天津市口腔医院组织工程实验室和天津大学材料学院高分子材料研究所完成。①通过相分离技术制备壳聚糖/明胶三维网络多孔支架,在支架材料表面原位沉积纳米级的羟基磷灰石晶体,构筑纳米羟基磷灰石/壳聚糖/明胶仿生骨组织工程支架材料,并进行表征和性能检测。②用酶消化法和条件培养法分离、诱导培养中国小型猪成骨细胞作为组织工程种子细胞。③用静态复合共培养法体外构建2种骨组织工程种植体样品:成骨细胞-纳米羟基磷灰石/壳聚糖/明胶仿生骨种植体,成骨细胞-纳米羟基磷灰石/胶原种植体。④采用扫描电镜、透射电镜、FDA荧光、LDH、MTT等定期观测仿生骨样品中细胞形态、细胞增殖速率、碱性磷酸酶活性、矿化结节形成等指标,以比较样品的细胞增殖活性和成骨活性。结果:①成功构筑了具有良好的生物相容性和力学相容性的纳米羟基磷灰石/壳聚糖/明胶,这种材料具有适于细胞黏附与生长的(90±1)%的孔隙率,孔径为100￣300μm的微孔结构,且原位沉积的纳米羟基磷灰石晶体的粒径为50nm左右,接近与天然骨的组成。②自中国小型猪腿骨成功分离培养了成骨细胞,并在诱导培养条件下,表现出很强的增殖活力和成骨活性,适合作为实验用骨组织工程的种子细胞。③成功构建了两种成骨细胞-可吸收载体种植体样品:经检验仿生构建的小型猪成骨细胞-纳米羟基磷灰石/壳聚糖/明胶种植体具有细胞亲和性和体外成骨活性。结论:①在体外成功仿生构建了结构与活性接近天然骨的骨组织工程种植体--纳米羟基磷灰石/壳聚糖/明胶种植体。②初步建立了仿生组织工程化非承载骨种植体的评价方法,为其进一步用于体内修复颅颌骨组织损伤的深化研究提供了实验数据和科学依据。     

彩色超声多普勒引导器官移植术患者颈内静脉穿刺及对并发症的监控效应

目的:为提高器官移植术患者颈内静脉穿刺置管的成功率及其安全性,减少并发症,应用彩色多普勒超声引导颈内静脉穿刺置管,并与采用传统的体表标志法穿刺者进行对比观察。方法:选择2004-11/2007-04南京医科大学附属无锡第一医院收治,预计穿刺较困难的肝移植及肾移植手术患者70例,根据患者意愿分为彩超定位组和对照组各35例。彩超定位组应用HDI5000型彩色多普勒超声显像仪进行实时立体定位,引导行颈内静脉穿刺置管并定期监控;对照组采用传统的体表标志法定位行颈内静脉穿刺置管。记录穿刺置管时间、成功率和并发症,穿刺置管成功后定期监控置入导管所在血管的血流情况、有无血栓形成或栓塞及飘浮导管的位置是否合适等。结果:70例均进入结果分析。①彩超定位组穿刺置管操作时间少于对照组(P<0.001)。②彩超定位组46次穿刺操作均一次成功,43次经颈内静脉单壁直接穿入,3例次穿过双壁,经稍退针后成功穿入,无一例次发生误穿动脉或其他并发症;对照组45次穿刺中,一次直接成功者20例次,6例次曾误穿入动脉。③21例肝移植患者均成功置入飘浮导管全程行有创心功能监测,术后监测发现4例有早期血栓形成。结论:①将彩色多普勒超声技术用于器官移植术患者颈内静脉穿刺时进行立体定位,引导穿刺置管,可明显提高穿刺置管的成功率和安全性。②通过术后定期监控,可了解导管位置是否保持准确及有无血栓形成等并发症发生。     

肾移植术后肺部感染特征97例分析

回顾性分析解放军总医院第二附属医院1992-05/2007-07收治的97例肾移植术后肺部感染患者的临床资料,患者对治疗方案均知情同意。①肺部感染多发生于术后1￣12个月,尤以术后2￣6个月多见,大剂量激素冲击多为诱因;重症肺部感染多为混合性感染,多为巨细胞病毒、真菌、耐药菌群和条件致病菌感染为主。②97例患者中肺部感染致急性呼吸窘迫综合征25例,13例死亡,死亡率达47.3%;在2007年,4例急性呼吸窘迫综合征中仅1例死亡,死亡率下降为20%,其中,1例最长呼吸机辅助呼吸达33d,患者痊愈出院;2个或2个以上器官障碍者死亡24例,最多见于上消化道出血和肾功能衰竭。③从2006-06开始,对于急性呼吸窘迫综合征患者早期T淋巴细胞亚群CD4 /CD8 <1%,即刻完全停用钙调神经磷酸酶抑制剂和抗细胞代谢免疫抑制剂,仅给小剂量的糖皮质激素,且血肌酐平均下降100mmol/L,其中1例完全停用达25d,血肌酐完全正常。④肾移植术后肺部感染发生率高,早期依据T淋巴细胞亚群和血肌酐的变化及时有效的减少或停用抗排斥药物及抗生素经验性用药是救治成功的前提。病情危重者(特别是急性呼吸窘迫综合征)及早呼吸末正压通气,充分保护其他脏器的正常功能,合理应用糖皮质激素和纤维支气管镜,密切加强各专业学科间协作等是救治成功的关键。     

慢性粒细胞性白血病干细胞抗伊马替尼机制的初步分析

目的：了解伊马替尼对慢性粒细胞性白血病患者体内BCR／ABL融合基因阳性的原始及定向白血病干，祖细胞分化及增殖的影响，从而更深入阐明部分慢性粒细胞性白血病患者在经历一段血液学甚至是细胞遗传学水平上的完全缓解后复发及对伊马替尼耐药的机制。 方法：实验于2006—09/2007—06在河南省血液病研究所完成。①对象：选取10例慢性粒细胞白血病患者，患者对治疗及实验知情同意：实验经医学伦理委员会批准。实验过程中应用的伊马替尼为Novartis公司产品，批号B-1701-0001-000005；氟波酯为浙川制药公司产品，批号030321495。②实验方法：抽取慢性粒细胞性白血病患者骨髓10mL，分离得到具有血液血管干细胞特性、BCR／ABL融合基因阳性的FIk1^＋CD31^-CD34细胞。以诱导造血集落的前48h，96h，120h内培养体系中含5μmol/L伊马替尼分别作为伊马替尼1，2，3组，设立空白对照，均体外培养18d，检测伊马替尼对造血集落培养基中的未分化及处于分化阶段的BCR／ABL融合基因阳性FIk1^＋CD31^-CD34细胞的增殖抑制作用。采用流式细胞术将BCR／ABL融合基因阳性FIk1^＋CD31^-CD34细胞分为3个亚群，即G0期、G1期及S/G2＋M期，分别评估氟波酯、伊马替尼、氟波酯联合伊马替尼对3个亚群细胞的体外增殖及凋亡的影响。 结果：①伊马替尼对处于分化阶段BCR／ABL融合基因阳性FIk1^＋CD31^-CD34细胞增殖及向血管内皮细胞分化的影响：与空白对照组比较，伊马替尼1组每1000个BCR／ABL融合基因阳性FIk1^＋CD31^-CD34细胞产生的粒-单系祖细胞集落数、红系爆式集落数无明显变化（P〉0．05），伊马替尼2，3组两种造血集落数均显著降低（P〈0．05）。在内皮诱导体系中与空白对照组比较，伊马替尼3组CD31^＋／vWF^＋细胞出现率明显降低（P〈0．05），且分化形成血管样结构的时间延迟。②伊马替尼诱导BCR／ABL融合基因阳性FIk1^＋CD31^-CD34细胞及其分化细胞凋亡的比较：5μmol/L伊马替尼作用48h后，BCR／ABL融合基因阳性FIk1^＋CD31^-CD34细胞凋亡数量明显低于其分化的造血、血管内皮细胞（P〈0．05）。③氟波酯联合伊马替尼对白血病干细胞体外分化及凋亡的影响：氟波酯联合伊马替尼能显著诱导处于G0期的BCR／ABL融合基因阳性FIk1^＋CD31^-CD34细胞分化为造血细胞，同时也能显著诱导其凋亡。单独应用氟波酯或伊马替尼均对处于Go期的BCR／ABL融合基因阳性FIk1^＋CD31^-CD34细胞凋亡无呀显影响．进入G，期及S/G2＋M期后有一定的促凋亡作用。 结论：①临床所观察到的慢性粒细胞性白血病患者在运用伊马替尼一段时间后出现正常的造血恢复现象，可能仅仅是因为伊马替尼清除了定向恶性白血病祖细胞的增殖。②氟波酯联合伊马替尼可有效诱导原始白血病干细胞的分化及凋亡。     

新生牛皮胶原蛋白海绵的制备及其体外细胞相容性

目的:采用新生牛皮提取胶原蛋白、制备生物医用胶原蛋白海绵,观察其生物学活性与细胞相容性。方法:实验于2006-05/2007-02在西北民族大学生命科学与工程学院生物工程与技术国家民委重点实验室完成。实验方法:①取出生24h内宰杀的新生尕里巴牛犊皮制备胶原蛋白海绵。②将新生牛皮胶原蛋白海绵与黑裘皮羔羊肾F3代成纤维细胞混悬液共培养,分别设胶原海绵材料组、阴性对照组(生理盐水)、阳性对照组(橡胶塞浸提液)。实验评估:①应用倒置相差显微镜观察细胞形态。②培养20,35d对细胞与胶原蛋白海绵共培养物进行AO染色观察细胞在胶原海绵中的增殖情况。③培养65d后制石蜡切片,行苏木精-伊红染色观察细胞在胶原海绵中的生长情况。结果:①细胞形态观察结果:阳性对照组细胞培养24h细胞圆缩,不贴壁,3d后全部死亡。胶原海绵材料组与阴性对照组细胞形态均正常,细胞贴壁生长良好。随着培养时间的延长,海绵孔隙逐渐变小,细胞数量增加,形态变小,海绵外观从柔软、混浊变得挺拔、透明。②细胞在胶原海绵中的增殖情况:吖啶橙-AO染色显示培养20,35d胶原海绵-羔羊肾成纤维细胞共培养物中有大量细胞存在,并且在胶原蛋白空隙中有大量细胞成团簇状生长。③细胞在胶原海绵中的生长情况:苏木精-伊红染色显示有大量蓝色细胞核和新生的红色胶原纤维。结论:制备的新生牛皮胶原蛋白海绵对岷县黑裘皮羔羊肾成纤维细胞有良好的生物相容性,无细胞毒性。