抗人肝癌单克隆抗体嵌合Fab在巴氏毕赤酵母中的高效分泌表达

目的:通过分步整合,用巴氏毕赤酵母表达抗人肝癌单克隆抗体(mAb)HAb18的嵌合Fab(cFab)片段。方法:将抗人肝癌mAbcFab/HAb18基因的原核表达载体pET32a/cFab中的CL和Fd段基因,分别亚克隆到酵母表达载体pPIC9K和pPICZαA中,构建重组质粒pPIC9K/CL和pPICZαA/Fd并测序鉴定。将重组质粒pPIC9K/CL和pPICZαA/Fd分步整合到酵母菌GS115的染色体上,经G418和Zeocin筛选高拷贝的转化子及鉴定Mut表型后,用含5mL/L甲醇的培养基诱导表达。结果:成功地表达抗人肝癌mAbHAb18的cFab,表达水平为26mg/L。Westernblot鉴定证实,表达产物具有良好的与HAb18结合的活性和特异性。结论:cFab/HAb18在巴氏毕赤酵母获得表达,为对其进一步大规模的生产和临床应用奠定了基础。     

转化生长因子β1对香烟诱导的大鼠肺泡巨噬细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合酶表达的影响

目的：探讨转化生长因子（TGF）-β1对香烟诱导的大鼠肺泡巨噬细胞γ-谷氨酰半胱氨酸合酶（γ-GCS）和活化蛋白(AP)-1亚单位c-fos mRNA及其蛋白表达的影响。方法:通过支气管肺泡灌洗获取大鼠肺泡巨噬细胞，随机分为对照组、香烟组和TGF-β1组。TGF-β1组加入终浓度为3 μg/L的TGF-β1,2 h后除对照组外，余2组均加入香烟烟雾提取物,对照组加入磷酸盐缓冲液。分别用逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）和免疫细胞化学方法检测肺泡巨噬细胞中γ-GCSh(重链亚单位)及c-fos mRNA和蛋白的表达。结果:香烟组γ-GCSh和c-fos mRNA及其蛋白表达水平显著高于对照组(分别P<0.05,P<0.01)。TGF-β1组γ-GCSh mRNA及其蛋白表达水平明显低于香烟组(均P<0.01)；而c-fos mRNA及其蛋白表达水平明显高于香烟组(均P<0.01)。结论:转化生长因子-β1参与香烟所致慢性阻塞性肺疾病肺氧化/抗氧化失衡的发病机制。     

HSP70对大鼠肝脏局部缺血再灌注后炎症反应的影响

目的：通过热应激预处理诱导HSP70表达，探讨其对肝脏缺血再灌注损伤后炎症反应的影响。方法:采用大鼠局部缺血再灌注模型（IR组），并在热应激预处理（H+IR组）及槲皮素＋热应激预处理（Q+H+IR组）条件下观察肝脏缺血再灌注后HSP70、ICAM-1的表达及MPO的活性；测定血清ALT和AST的活性；电镜观察肝细胞结构的改变。结果:在H+IR组检测的各时点HSP70表达均明显高于其它两组、对肝脏进行缺血再灌注后，肝细胞损伤较轻，血清ALT、AST升高不明显(P<0.01)；肝组织中ICAM-1表达增加，以再灌注后6 h最显著，MPO活性升高以12 h最为显著，但两者变化均低于IR组和Q+H+IR组(P<0.01)。结论：〖HTSS〗热应激预处理诱导产生HSP70蛋白能够降低大鼠肝脏缺血再灌注损伤过程ICAM-1的表达和MPO活性的改变，进而抑制炎症反应引起的肝脏损伤。     

树突状细胞在胆囊癌组织内浸润的研究

目的通过对胆囊癌组织中树突状细胞浸润情况的研究,阐述树突状细胞与肿瘤免疫之间的关系。方法采用免疫组化SP法。结果树突状细胞在胆囊癌组织的浸润程度与年龄、性别和病理组织学类型无关,与病理分化程度呈负相关关系(P<005)。结论树突状细胞在胆囊癌组织的浸润程度与病理分化程度、Nevin分期、肝浸润及淋巴结转移存在密切的关系。树突状细胞的定量检测可作为估计胆囊癌预后的标志。     

大鼠β细胞素蛋白的表达、纯化及生物学活性鉴定

目的:获得大量重组大鼠β细胞素并检测其活性。方法:用PCR法从大鼠肾组织中扩增534bp的β细胞素基因片段,并按读框克隆到原核表达载体pET28a( )中。以构建的重组质粒pET28a-rBTC转化大肠杆菌BL-21(DE3)菌株,在IPTG诱导下表达β细胞素蛋白,表达产物用SDS-PAGE和Westernblot检测。采用镍柱亲和层析法纯化目的蛋白。结果:经IPTG诱导后,在大肠杆菌中可表达相对分子质量Mr为20000的目的蛋白。目的蛋白主要以包涵体的形式表达;表达量约占菌体蛋白总量的20%～30%。表达的目的蛋白与抗His标签抗体具有良好的反应性。结论:大鼠β细胞素基因在PET表达系统中得到高效表达;蛋白复性后能有效地促进NIH3T3细胞的体外增殖。     

抗肝癌细胞噬菌体单链抗体库的构建及筛选

构建抗人肝癌细胞单链抗体库 ,从中筛选与肝癌细胞特异结合的高亲和力单链抗体。从HepG2细胞免疫的BALB/c小鼠脾脏提取总RNA ,RT PCR扩增小鼠抗体重、轻链可变区基因 ,用 (Gly4Ser) 3 连接肽基因 ,经重叠延伸反应 ,在体外将VH 和VL 连接成单链抗体 (scFv)基因 ,并克隆入噬菌粒载体pCANTAB5E中 ,构建噬菌体单链抗体库。以HepG2细胞为抗原对抗体库进行淘选 ,ELISA法鉴定各单克隆与肝癌细胞的结合活性 ,并对阳性克隆进行表达。成功构建了库容为 1 1× 10 6抗肝癌细胞的噬菌体单链抗体库 ,经筛选得到了与HepG2细胞具有较强结合能力的单链抗体 ,实现了scFv在大肠杆菌中的可溶性表达。序列测定结果表明 ,VH 和VL 基因符合小鼠抗体可变区特征 ,scFv基因拼接正确     

骨髓间充质干细胞异体移植免疫反应的研究进展

骨髓间充质干细胞（BMSC）具有独特的生物学特性，其免疫抑制作用引起了人们广泛的兴趣。大量资料表明，MSC能在同种异基因，甚至异种基因的环境中长期存活，并且保持它的多向分化潜能。这一特性使MSC异体移植预防和治疗免疫性疾病成为可能。因此有必要从问充质干细胞的低免疫原性、灯免疫细胞及补体系统的调节和诱导抑制性免疫微环境等方面探讨BMSC避免同种异体移植排斥反应的可能机制。     

巢式序列特异性引物PCR方法检测HLA单倍体相合供受者间母胎微嵌合的临床应用研究

目的探索临床应用巢式序列特异性引物聚合酶链式反应（PCR-SSP）方法检测HLA单倍体相合供受者间母胎微嵌合状态的可行性。方法选取25对拟行HLA单倍体相合造血干细胞移植治疗的实体肿瘤患者及其供者,供受者为母子关系15例,父子关系10例。采集供受者外周血提取基因组DNA,采用巢式PCR-SSP方法检测患者外周血中供者来源的HLA-DRB1位点,并计算母胎微嵌合阳性率。随机选取经巢式PCR-SSP证实嵌合阳性和阴性且供受者性别不同的患者各4例,采用荧光原位杂交（FISH）技术进行重复检测,并与巢式PCR-SSP方法的检测阳性率进行比较,同时采用噻唑蓝法检测这8例患者分别与其亲缘供者和HLA完全不相合无关第3人之间的混合淋巴细胞增殖反应（MLR）,并计算增殖指数（SI）。结果巢式PCR-SSP方法灵敏度可高达0.001%,并具有较好的特异性。巢式PCR-SSP检测显示,在母子移植关系患者中母胎微嵌合阳性检出率为40%（6/15）,而在父子移植关系患者中母胎微嵌合阳性检出率为0。巢式PCR-SSP方法的检测灵敏度与FISH技术相比明显增高,其检测阳性率分别为50%（4/8）和12.5%（1/8）。MLR检测显示,嵌合阳性患者对其亲缘供者和无关第3人外周血单个核细胞（PBMC）的SI分别为（0.949±0.023）、（1.320±0.095）,嵌合阴性患者对其亲缘供者和无关第3人PBMC的SI分别为（1.133±0.036）、（1.245±0.069）;嵌合阳性患者对其亲缘供者PBMC的增殖反应强度与嵌合阴性患者相比明显降低（P=0.001）,并且也显著低于其对无关第3人PBMC的增殖反应强度（P=0.003）。结论巢式PCR-SSP方法灵敏度高、特异性好,适用于临床HLA单倍体相合供受者间母胎微嵌合状态的快速检测。     

AAV2-BPI700-Fcγ1700重组病毒的制备及其转染小鼠后的抗感染作用

目的 通过观测BPI700-Fcγ1 7001嵌合基因导入小鼠对最小致死量E．coli感染攻击的抵抗作用，探讨基因治疗在细菌感染性疾病中应用的可能性。方法采用RT-PCR检测嵌合基因在转录水平的表达；采用免疫组化和酶联免疫吸附实验检测嵌合基因在蛋白水平的表达。结果（1）基因导入小鼠中目的嵌合基因得到表达，在注射部位肌肉组织和血清中可检测到目的嵌合蛋白；（2）在最小致死量E．coli感染攻击后，基因导入小鼠的存活率为31．43％，明显高于对照组小鼠的存活率4．62％；与小剂量头孢呋辛钠联合应用其存活率高达65％。结论BPI700-Fcγ1 700嵌合基因导入小鼠对致死量E．coli感染具有较好抵抗作用，提示抗感染基因治疗在细菌感染性疾病，特别是在感染高危人群中具有广阔的临床应用前景。     

急诊腹腔镜治疗出血性宫外孕202例临床分析

目的探讨急诊腹腔镜治疗出血性宫外孕的可能性、优越性。方法回顾分析1998年8月~2005年10月急诊腹腔镜出血性宫外孕402例,随机分为腹腔镜组202例,开腹组200例。比较两组手术时间、并发症、术后病率、术后输卵管通畅情况。结果腹腔镜比开腹手术住院时间短、术后恢复快、并发症少、术后病率少。手术时间,腹腔镜组(1998年8月~2001年12月)比开腹手术组长,(2002年1月~2005年10月)短于开腹组,结论腹腔镜手术应用于急腹症出血性宫外孕,当休克早期,在抗休克的同时行腹腔镜手术较安全、有效,病人术后恢复快、不增加并发症,更适应有生育要求患者。