分子生物学技术在疟疾诊断中的应用与展望

疟疾与艾滋病、结核是世界公认的危害人类生命健康的三大公共问题之一。世界卫生组织报告,2016年全球还有44.5万人死于疟疾,疟疾的早期快速诊断对于及时治疗感染病例,降低死亡率,显得尤为重要。疟原虫诊断主要分为病原学诊断、免疫学诊断和分子生物学诊断。传统病原学诊断是疟疾诊断公认的“金标准”,但是在实际的临床应用中,病原体检测较为费时费力,且受专业镜检人员匮乏,临床经验等因素限制,容易造成漏诊和误诊,已远不能满足疟疾防治工作的需要。免疫学诊断主要采用检测抗原、抗体的血清学方法,由于可用于检测的特异性抗原较少、抗原抗体反应的干扰因素较多,血清抗体产生的时间较长等因素,使疟疾诊断的准确性和及时性上还有待提高。进入21世纪,随着核酸探针、聚合酶链反应、环介导等温扩增技术、下一代测序技术等的应用,为疟原虫的实验室检测提供了新的途径,表现出了越来越高的敏感度和特异度。本文就分子生物学技术在疟疾诊断领域中的应用与展望作一综述。     

鲁南五市疟疾联防区2003～2007年疟疾疫情分析

目的分析鲁南五市疟疾联防区疟疾发病特点及流行规律，为疟防后期监测及制定防治对策提供依据。方法对鲁南五市疾病预防控制中心上报的当地感染、输入性疟疾或疑似病例进行登记和确诊，并逐一进行流行病学调查和资料的整理、统计与分析。结果鲁南五市2005～2007年疟疾病例呈明显上升趋势，发病例数比2004年分别上升293％、586％和686％，以枣庄、济宁和菏泽增多最明显。疟疾病例以间日疟和新发病例为主，既高度分散又相对集中，且当地感染病例明显增加。男性高于女性，以农民和民工发病最多。结论鲁南五卞联防区的疟疾疫情呈上升趋势，尤其靠近江苏、安徽和河南的市县为今后疟疾防治工作的重点地区。加强联防和流动人口管理，提高各级疟防人员的专业水平是今后工作的主要任务。     

巢式PCR法检测弓形虫的应用研究

目的 调查山东省商品肉弓形虫污染和动物弓形虫感染情况，并进行SAG2分型研究，分析商业肉制品在弓形虫传播中的作用。方法自由市场采集商品内，用巢式PCR方法检测弓形虫DNA，阳性经纯化PCR产物，进行SAG2临床分型研究。结果共检测商品内89份，阳性22份，阳性率为24．72％。其中，猪肉标本56份，16份阳性，阳性率为28．57％，Ⅰ型13份，Ⅱ型1份，Ⅱ型与Ⅰ型混合感染1份，未能定型1份；羊肉标本33份，6份阳性，阳性率为18.18％，Ⅰ型5份，Ⅱ型与Ⅰ型混合感染1份。22份阳性标本中单纯Ⅰ型占81、82％，Ⅱ型与Ⅰ型混合感染占9．09％，Ⅲ型未能检测到。1份可疑病人血标本阳性，为Ⅰ型。结论肉类弓形虫污染率很高，以Ⅰ型为主，是人类感染的重要来源。家庭食品加工过程中生熟不分与人们对食品鲜美的追求造成误食包囊感染，可能是造成人类弓形虫感染率大幅升高的最为重要的原因之一。     

应用DASS-FAT诊断华支睾吸虫病

目的　探讨DASS -FAT方法检测血清抗体诊断华支睾吸虫病的应用价值。方法　通过人工培养华支睾吸虫成虫获取ES抗原。将ES抗原与Sepharose - 4B偶联 ,应用FAT技术测定血清中华支睾吸虫特异性抗体。 结果　 83例华支睾吸虫感染者血清全部呈阳性反应 ,阳性率为 10 0 % ,健康人群的抗体阳性率为 2 0 4 % (2 8/ 1372 ) ;88例脑囊虫病及 5 5例肠道寄生虫感染者血清的抗体阳性率分别为 2 2 7% (2 / 88)和 1 80 % (1/ 5 5 ) ,与健康人群比较无明显交叉阳性反应 (χ2 =0 0 2 1,P >0 1) ;华支睾吸虫感染者经治疗后 12个月 ,血清特异抗体检出率明显下降 ,有77 78% (2 8/ 36 )的感染者抗体转阴。结论　应用DASS -FST方法检测血清中华支睾吸虫特异性抗体具有较高的敏感性和特异性 ,非华支睾吸虫感染者血清无明显交叉阳性反应。该方法简便、快速、稳定性好 ,可用于华支睾吸虫病的感染诊断、疗效评价、流行病学调查及基础免疫研究。     

抗弓形虫P30单克隆抗体的制备及其抗虫作用观察

制备抗弓形虫天然P30、重组P30的单克隆抗体(mAb),并研究它们对虫体的影响,为弓形虫病诊断及保护性抗原鉴定奠定基础。采用弓形虫天然P30、重组P30及全虫抗原(对照)分别免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,筛选稳定分泌高滴度mAb的杂交瘤细胞株。用ELISA法测定mAb亚类和效价;通过SDS-PAGE和West-ern blot进行特异性鉴定;Giemsa染色观察杂交瘤细胞的染色体数目;利用扫描电镜及间接荧光抗体试验(IFAT)观察mAb对弓形虫的杀伤作用及其靶抗原定位。结果表明,筛选出2株(2B3、1H6)特异性较好、能稳定分泌mAb的杂交瘤细胞株。Western blot结果显示,2B3、1H6产生的mAb与弓形虫全抗原的阳性反应带均在30 000 Mr处;mAb亚类均属IgM,其效价(ELISA)分别为:2B3 1∶102 400、1H6 1∶51 200;2株细胞的染色体数均在100条以上。电镜观察与mAb作用后的弓形虫虫体聚集、肿胀,膜变厚,表面出现缺口和空洞,甚至虫体变形、破碎。抗弓形虫天然P30的mAb能识别重组体pET-30a-P30的表达蛋白。成功制备了抗弓形虫天然P30、重组P30的mAb,可进一步用于弓形虫病诊断及保护性抗原鉴定研究。     

山东省华支睾吸虫病分布及流行趋势分析

目的了解山东省华支睾吸虫病分布范围及流行趋势，为制定下一步防治策略提供科学依据。方法采用改良加滕厚涂片（Kato—Katz）法粪检华支睾吸虫卵。收集既往资料与现场调查数据作统计分析。结果1987年前全省107个县有华支睾吸虫病流行，受威胁的县为77％（107／139）。人群平均感染率1．5％，感染人数约113万。经40余年的综合防治，至2003年华支睾吸虫人群平均感染率下降为0．06％，下降了96．0％。流行县由原来的107降为51个，受威胁的县下降为36，7％，较前下降了52．3％。感染者由113万下降为5万人左右。轻度感染者由原来的63．7％上升为88．2％。结论山东省华支睾吸虫病流行范围呈逐渐缩小，受威胁人口数逐年下降；人群平均感染率降到历史最低水平，88．2％的感染者为轻度感染，基本达到控制传播流行。     

微小隐孢子虫重组BCG疫苗免疫保护作用观察

目的研究微小隐孢子虫重组BCG疫苗的免疫保护作用。方法 100只BALB/c小鼠随机分为4组,BCG组免疫BCG,载体组免疫含PMV262质粒的BCG(BCG-PMV262),实验组免疫rBCG-CP15/60-23(各组均为每鼠尾静脉注射0.1mL,接种物浓度均为106细菌/mL),对照组每鼠尾静脉注射0.05mol/LpH7.2PBS0.1mL。免疫后,每组分别随机选6只小鼠检测其血清抗体和脾细胞培养液中的CD4+、CD8+以及细胞因子水平,各组剩余小鼠进行攻击实验。结果 rBCG-CP15/60-23能诱发小鼠产生细胞免疫和体液免疫反应,小鼠血清抗体水平于免疫后2周逐渐升高,与BCG组和载体组差异显著(P均<0.01);实验组CD4+T细胞增殖明显,CD4+/CD8+比值显著升高(P<0.05);脾细胞培养液中白细胞介素2(IL-2)、IL-12、γ干扰素(IFN-γ)均有不同程度的升高,实验组IFN-γ和IL-2含量与对照组和BCG组差异显著(P均<0.05),IL-12水平组间差异无统计学意义(P>0.05)。各组小鼠经隐孢子虫卵囊攻击感染后,实验组小鼠卵囊排泄数量减少40%～60%,初始排卵囊时间延长2d,卵囊持续排出时间缩短5d;组间差异有统计学意义(P<0.05)。结论微小隐孢子虫重组BCG-CP15/60-23疫苗免疫小鼠后,能产生良好的免疫保护作用。     

刚地弓形虫P30（SAGl）基因的克隆与表达

目的 构建弓形虫P30基因表达载体并获得重组表达蛋白。方法 将弓形虫P30基因的开读框用PCR扩增，NcoⅠ和Hind Ⅲ酶切后，与同样酶切的表达质粒pET-30a( )经T4连接酶连接，然后转化到DH5a中。菌液经PCR扩增和质粒酶切及基因测序鉴定后，将阳性重组质粒转化到大肠埃希菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导，表达产物用SDSPAGE和Western blot进行鉴定。结果 扩增的P30基因片段为750bp，重组质粒诱导表达产物分子质量单位为30ku，与理论值相符。Western blot确认重组质粒表达蛋白与小鼠抗弓形虫单克隆抗体(P30McAb)发生特异性反应。结论 成功构建重组体并获得弓形虫主要表面抗原P30的高效表达产物，为弓形虫病的诊断和疫苗研究奠定了基础。     

RT-PCR检测脑囊虫病患者IFN-γ和IL-10的研究

目的探讨脑囊虫病患者体内γ-干扰素(IFN-γ)和白细胞介素-10(IL-10)的水平. 方法采用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)检测27例脑囊虫病患者外周血单个核细胞产生IFN-γ(代表Th1水平)和IL-10(代表Th2水平)两种细胞因子的变化. 结果 24例有细胞因子表达,3例未测出.在24例有细胞因子表达的患者中,7例表达IFN-γ和IL-10两种细胞因子,17例仅表达IL-10. 结论脑囊虫病患者存在Th1/Th2的漂移现象,明显表现为Th2型细胞因子表达,细胞免疫功能低下,而体液免疫功能升高,存在Th1/Th2平衡失调.     

微小隐孢子虫表面抗原CP23基因的克隆及表达

目的 构建微小隐孢子虫表面抗原CP23基因表达载体并获得重组表达蛋白。方法 用微小隐孢子虫卵囊感染免疫抑制BALB／c小鼠，用不连续蔗糖密度梯度离心法纯化微小隐孢子虫卵囊，用酚一氯仿抽提法提取微小隐孢子虫基因组DNA，PCR扩增CP23基因片段，然后克隆至TA载体；通过酶切、测序鉴定后，将CP23基因片段用限制性内切酶切下克隆至pET-30a（＋）载体，构建pET-30a-23质粒，转化大肠埃希菌BL21（DE3），IPTG诱导表达，表达蛋白用SDS-PAGE和Westernblot分析鉴定。结果 扩增出约340bp的微小隐孢子虫CP23基因片段并成功构建pET～30a-23质粒，表达出分子质量单位为27ku的融合蛋白，Westernblot显示该蛋白能被抗微小隐孢子虫血清识别。结论 成功构建pET-30a-23质粒，表达产物具有免疫反应性，为微小隐孢子虫的免疫学诊断及疫苗研制打下了基础。