Ag85B与MPT64 DNA疫苗联合免疫对鼠结核分枝杆菌感染的保护作用

目的　研究Ag85B与MPT6 4DNA疫苗联合免疫对鼠结核分枝杆菌感染的免疫保护效果。方法　C5 7BL/ 6小鼠 5 4只 ,采用随机数字表法随机分为 6组 ,分别用磷酸盐缓冲液 (PBS)、pcDNA3 1( )、卡介苗 (BCG)、pcDNA/Ag85B、pcDNA/MPT6 4、pcDNA/Ag85B pcDNA/MPT6 4经肌肉注射法免疫小鼠 ,0、3、6周各 1次 ,即PBS组、pcDNA3 1组、BCG组、pcDNA/Ag85B组、pcDNA/MPT6 4组及pcDNA/Ag85B pcDNA/MPT6 4组。BCG组只在 0周予皮内注射卡介苗 1次。末次免疫后第 5周用 1×10 6CFU的H3 7Rv经尾静脉实施攻击 ,攻击后 6周处死部分小鼠 ,用酶联免疫吸附测定 (ELISA)法检测血清总IgG、纯化蛋白衍生物 (PPD)特异性脾淋巴细胞干扰素γ(IFN γ)和白细胞介素 4 (IL 4 )分泌水平 ,四甲基偶氮唑盐 (MTT)法测定特异性脾淋巴细胞增殖 ;作脾、肺组织荷菌量和病理学检查 ,并观察小鼠存活时间。结果　PBS组肺和脾器官荷菌量分别为lg-1(7 85 4± 0 0 0 3)CFU/g和lg-1(7 190±0 0 16 )CFU/g、pcDNA3.1组分别为lg-1(7 70 0± 0 0 16 )CFU/g和lg-1(7 0 72± 0 0 6 8)CFU/g、BCG组分别为lg-1(6 4 4 9± 0 0 0 2 )CFU/g和lg-1(5 4 36± 0 0 4 2 )CFU/g、pcDNA/Ag85B组分别为lg-1(7 370± 0 0 0 2 )CFU/g和lg-1(6 4 2 96± 0 0 0 9)C     

结核分枝杆菌Ag85B-Ag85A双抗原融合真核表达质粒的构建及表达

目的：构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B-Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体．方法：采用gene SOE-ing法将Ag85B和Ag85A编码基因用疏水甘氨酸接头(Gly4Ser)3行PCR扩增融合，经限制性内切酶消化后克隆入pcDNA3．1( )中构建真核表达质粒pCDAg85B-A，酶切、DNA测序鉴定，用脂质体法将pCDAg85B-A转染COS-7细胞，采用RT-PCR，ELISA方法检测其表达．结果：Ag85B-Ag85A融合基因定向克隆人pcDNA3．1( )，双向测序表明碱基无突变，Ag85B-Ag85A融合基因在真核细胞中能表达．结论：成功构建结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B-Ag85A融合基因及其双价抗原真核表达载体，为结核病基因疫苗的研究奠定基础．     

结核分枝杆菌Ag85B与MPT64真核共表达质粒的构建及表达

目的:构建结核分枝杆菌Ag85B和MPT64编码基因的共表达载体pBud85B-MPT.方法:将结核分枝杆菌Ag85B、MPT64基因同时克隆进多启动子共表达载体pBudCE4.1中,得到真核共表达质粒pBud85B-MPT;将pBud85B-MPT转染COS-7细胞,通过RT-PCR方法检测目的基因的表达.结果:在COS-7细胞中同时检测到Ag85B、MPT64的表达.结论:pBud85B-MPT共表达质粒构建成功,为进一步研究新型结核病疫苗奠定基础.     

结核分枝杆菌esat6基因原核表达载体的构建和表达

目的：构建结核分枝杆菌(MTb)esat6基因原核表达载体并进行表达。方法：PCR扩增MTbeast6基因，克隆入pQE30质粒，测序正确后，再亚克隆入pET32a( )质粒，构建PQE30—ESAT6和PET32a( )—ESAT6重组体。结果：重组体分别转化DH5α和BL21(DE3)菌后，经IPTG诱导，pQE30—ESAT6未表达目的蛋白，而PET32α( )—ESAT6表达出19kDA左右重组蛋白。SDS—PAGE分析显示，IPTG诱导4h重组蛋白表达量最高，表达蛋白以可溶性非包涵体形式存在于胞浆中，表达量占全菌蛋白质的42％，用Westermblotting证实其有良好的抗原性；经过Ni—NTA柱纯化，获得纯度为92％的重组蛋白。结论：成功构建原核表达载体pET32a( )—ESAT6，并获得重组ESAT6蛋白，为MTb重组抗原的应用奠定基础。     

结核分枝杆菌MPT64真核表达质粒的构建

目的 构建结核分枝杆菌MPT64真核表达质粒。观察其在抗结核杆菌感染中的预防保护作用。方法 从H37Rv基因组中扩增出MPT64基因，经限制性内切酶消化后。定向插入pcDNA3.1( )中，结果 成功扩增出MPT64编码基因。经HindⅢ和BamHI酶切和PCR鉴定。MPT64基因正确插入pcDNA3.1( )中，DNA序列测定无突变产生。结论 成功地构建了结构分枝杆菌MPT64真核表达质粒。为进一步研究MPT64在抗结核杆菌感染中的预防作用奠定了基础。     

胸腰椎结核的外科治疗体会(附34例报告)

近年来由于耐药细菌的增加使结核病死灰复燃 ,其中脊柱结核的危险性大、致残率高 ,直接影响到患者的生命质量 ,因此合理而有效的临床治疗十分重要。本文回顾分析了过去 10年间 34例胸腰椎结核的外科治疗效果 ,深深体会到只有采用合理而规律的药物化疗方案 ,选择正确而有效的手术治疗方法 ,才能彻底治愈脊柱结核并预防复发。1　资料与方法1 1　一般资料　 34例中男 13例 ,女 2 1例 ,年龄 17岁以下 4例 ,18～ 35岁 14例 ,36～ 6 0岁 8例 ,6 0岁以上 8例。其中胸椎结核 18例 ,胸腰段结核 6例 ,腰椎结核 10例。按Ｆｒａｎｋｅｌ分类法进行神经功…     

用结核分枝杆菌HSP70启动子构建分枝杆菌穿梭表达质粒的研究

目的：用结核分枝杆菌HSP70(Heat shock protein70，HSP70)启动子改建分枝杆菌穿梭质粒pJEM11为分枝杆菌穿梭表达质粒。方法：利用聚合酶链反应(Polymerase chain reaction，PCR)扩增H37Rv基因组419607～419835位的HSP70启动子及调控序列，末端引入一个多克隆位点(Multiple clone sites，MCS)，再定向克隆人pJEM11的ApaI位点与XbaI位点之间，构建pJCH02载体，并对载体进行酶切鉴定及序列测定。将lhp-esat6融合基因克隆人pJCH02载体，评价其在BCG中的表达情况。结果：HSP70启动子、调控序列及引入的多克隆位点完全正确，lhp-esat6基因在BCG中成功表达。结论：成功改建穿梭质粒pJEM11为穿梭表达质粒pJCH02。本研究为构建BCG多价疫苗奠定了基础。     

结核分枝杆菌lhp基因原核表达载体的构建和表达

目的：构建结核分枝杆菌(MTB)lhp和基因原核表达载体并进行表达。方法：用PCR扩增MTB lhp基因，并克隆入pQE30质粒。测序正确后，再亚克隆入pET32a( )质粒，构建pQE30—CFP10和pET32a( )—CFP10重组体。结果：以重组体分别转化DH5α和BL21(DE3)菌后，经IPTG诱导，pQE30—CFP10未表达目的蛋白；而pET32a( )—CFP10则表达出Mr为20000左右重组蛋白。SDS—PAGE分析显示，IPTG诱导4h重组蛋白的表达量最高：表达蛋白以可溶性非包涵体形式存在于胞质中，表达量占全菌蛋白质的38%，用Western blot证实其具有良好的抗原性。经Ni—NTA柱纯化，获得纯度为93%的重组蛋白。结论：成功地构建原核表达载体pET32a( )—CFP10，并获得重组CFP10蛋白，为MTB重组抗原的应用奠定了基础。     

结核分枝杆菌潜伏感染相关蛋白ICL的表达及鉴定

目的　表达结核分枝杆菌潜伏感染相关蛋白ICL ,鉴定其生物学活性并制备其多克隆抗体。方法　采用PCR法从结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA中扩增出icl基因片段 ,将其插入原核表达质粒pQE30 ,构建重组质粒 pQE30 icl。将pQE30 icl转化大肠杆菌 ,用IPTG诱导目的基因表达。Western blot免疫印迹法鉴定后纯化该表达产物 ,测定其酶活性并用此纯化蛋白免疫新西兰兔制备多克隆抗体。结果　序列分析发现PCR扩得的icl有两个核苷酸突变 ,但均为无义突变。在大肠杆菌中表达的目的产物经SDS PAGE分析约为 4 7kDa。免疫印迹分析证实目的蛋白与阳性结核病患者抗血清产生特异性反应。纯化的目的蛋白异柠檬酸裂解酶的酶活性为 16 .7u/mg。双向免疫扩散法测定目的蛋白免疫兔血清的抗体效价为 1 32。结论　研制出的结核分枝杆菌重组ICL具有异柠檬酸裂解酶活性和抗原性 ,重组ICL和抗ICL免疫血清的制备为抗结核分枝杆菌潜伏感染的研究奠定了必要的物质基础。     

小鼠psIL-12质粒抗结核分枝杆菌感染的研究

目的观察、评价小鼠白细胞介素12真核表达质粒psIL-12对结核分枝杆菌感染小鼠细胞因子水平的影响及疗效.方法结核分枝杆菌H37Rv感染的C57BL/J6小鼠随机分成生理盐水、pcDNA3.1对照组,psIL-12治疗组,每组各6只.感染4周后分别予以生理盐水、pcDNA3.1、psIL-12,第1次治疗后8周处死检测器官活菌数,脏器重量指数(WI),脾淋巴细胞特异性IFN-γ、IL-4细胞因子分泌水平,并观察肺、脾组织病理改变情况.结果 psIL-12治疗组肺组织活菌数(每mg log10CFU/ml)为7.41±0.50,与对照组(8.15±0.37、8.19±0.29)比较显著降低(P＜0.05);脾组织荷菌量(每mg log10 CFU/ml)为5.31±0.21,与对照组(5.76±016、5.88±0.21)比较显著降低(P＜0.05).psIL-12治疗组脾脏重量指数为0.58±0.05,与对照组(1.02±0.08、1.10±0.02)比较显著降低(P＜0.05).脾淋巴细胞IFN-γ(pg/ml)为478.0±10.1,与对照组(134.5±15.7、125.1±8.2)比较显著升高(P＜0.05).各组间IL-4水平差异无显著性.对照组肺组织病理改变以变质、渗出为主,而psIL-12治疗组以增生改变为主.对照组与治疗组间比较脾脏病理改变不明显.结论 psIL-12真核表达质粒对小鼠结核分枝杆菌感染有一定的治疗作用,可能通过诱导促进IFN-γ产生,调节TH1/TH2应答类型,起到抗结核分枝杆菌感染的作用.