人精胺氧化酶的原核表达及多克隆抗体制备

目的:克隆、原核表达有酶活性的重组人精胺氧化酶(SMO)蛋白,并制备兔抗人SMO多克隆抗体.方法:采用RT-PCR法从人非小细胞肺腺癌A549细胞株总RNA中克隆人精胺氧化酶cDNA,构建SMO原核表达质粒pET-15b/SMO.将SMO原核表达质粒转化E.coli的BL21(DE3)菌并使用IPTG诱导重组SMO表达.表达的蛋白产物经Ni-NTA亲和层析纯化、透析复性后,化学荧光法测定其酶活性.使用制备性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、纯化重组人SMO蛋白,以此蛋白作为抗原皮内接种日本大耳白兔来制备抗人SMO多克隆抗体.分别以ELISA、Western blot和免疫细胞化学法检测兔血清中抗体的滴度和抗原特异性.结果:纯化并透析复性后的重组人SMO蛋白具备快速氧化精胺的酶活性.用此重组蛋白制备的抗体具有较高抗体滴度和针对人SMO的特异性.结论:建立了人SMO原核表达、纯化系统,获得了有酶活性的高纯度人SMO蛋白并成功制备了兔抗人SMO的多克隆抗体,为以SMO为靶点的抗肿瘤基础和临床研究提供了有力的研究工具.     

HIV-1 p15（Gag）基因的克隆、蛋白表达及抗体制备

目的:构建HIV-1p15(Gag)原核表达载体,诱导蛋白表达及制备多克隆抗体。方法:用PCR的方法扩增编码p15(Gag)基因序列,将其克隆到原核表达载体pET28a( )中,利用大肠杆菌表达系统表达HIV-1p15蛋白,分别用His抗体和HIV阳性血清做western blot鉴定目的蛋白的免疫原性。纯化目的蛋白免疫家兔,制备多克隆抗体。通过酶联免疫吸附实验(ELISA),细胞免疫组织化学法检测抗体滴度及其特异性。结果:原核表达载体pET28a( )-p15(Gag)成功构建,可在大肠杆菌BL21(DE3)中用IPTG诱导表达,得到相对分子质量约20KD的p15(Gag)蛋白,经western blot鉴定正确。纯化蛋白免疫家兔,制备的多克隆抗体具有较强免疫特异性。结论:得到纯化的HIV-1p15蛋白,制备的多克隆抗体能够检测自然状态下病毒蛋白p15(Gag),为进一步研究HIV-1奠定了实验基础。     

用SiRNA沉默SSAT基因表达降低人A549肺癌细胞对抗癌多胺类似物CPENSpm的敏感性

目的 探讨精脒/精胺乙酰转移酶(Spermidine/Spermine N1-Acetyltransferase,SSAT)基因表达沉默对多胺类似物CPENSpm抗瘤活性的影响。方法 用SiRNA技术获得SSAT基因表达沉默的人A549肺癌细胞株,QT-RT-PCR 法用于分析SSAT基因的表达水平,MTT法检测细胞的存活率,DNA片段化分析和流式细胞/亚凋亡峰分析检测细胞凋亡状况。结果 成功获得SSAT基因表达沉默的人A549肺癌细胞株。用10 μmol·L^-1 CPENSpm处理对照细胞24 h可使SSAT mRNA 水平升高23倍,但在SSAT表达沉默的细胞中CPENSpm无此影响。细胞增殖实验发现,SSAT表达沉默的细胞对CPENSpm (0~20 μmol·L^-1 )的药物敏感性显著性低于对照细胞。细胞凋亡分析发现,10 μmol·L^-1 CPENSpm处理细胞48 h导致对照细胞出现凋亡细胞典型的DNA片段化现象和亚凋亡峰,但在SSAT表达沉默的细胞株中,CPENSpm诱导细胞凋亡的能力明显减弱。结论 CPENSpm诱导肿瘤细胞内SSAT高表达可能是其抗癌药理活性的分子基础之一。     

用SiRNA沉默SSAT基因表达降低人A549肺癌细胞对抗癌多胺类似物CPENSpm的敏感性

目的探讨精脒/精胺乙酰转移酶（Spermidine/Spermine N^1-Acetyltransferase,SSAT）基因表达沉默对多胺类似物CPENSpm抗瘤活性的影响。方法用SiRNA技术获得SSAT基因表达沉默的人A549肺癌细胞株,QT-RT-PCR法用于分析SSAT基因的表达水平,MTT法检测细胞的存活率,DNA片段化分析和流式细胞/亚凋亡峰分析检测细胞凋亡状况。结果成功获得SSAT基因表达沉默的人A549肺癌细胞株。用10μmol·L^-1CPENSpm处理对照细胞24h可使SSAT mRNA水平升高23倍,但在SSAT表达沉默的细胞中CPENSpm无此影响。细胞增殖实验发现,SSAT表达沉默的细胞对CPENSpm（0～20μmol·L^-1）的药物敏感性显著性低于对照细胞。细胞凋亡分析发现,10μmol·L^-1CPENSpm处理细胞48h导致对照细胞出现凋亡细胞典型的DNA片段化现象和亚凋亡峰,但在SSAT表达沉默的细胞株中,CPENSpm诱导细胞凋亡的能力明显减弱。结论CPENSpm诱导肿瘤细胞内SSAT高表达可能是其抗癌药理活性的分子基础之一。     

京尼平苷干预体外培养大鼠软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白的合成

背景：近年来的研究表明,中药栀子可能具有活化软骨细胞的功能,而京尼平苷是栀子中重要成分之一。目的：观察京尼平苷对体外培养大鼠膝关节软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白合成的影响。方法：体外分离培养大鼠膝关节软骨细胞,分别应用25,50及100 mmol/L京尼平苷干预,并设置正常对照组。RT-PCR和Western blot法观察京尼平苷对各组细胞Ⅱ型胶原mRNA和蛋白表达的影响。结果与结论：RT-PCR和Western blot法检测结果显示,与正常对照组相比,25,50及100 mmol/L京尼平苷干预可以明显促进Ⅱ型胶原mRNA及蛋白的表达（P 〈0.01）。结果证实,京尼平苷可以促进大鼠膝关节软骨细胞Ⅱ型胶原蛋白的合成。     

天津市孤独症谱系障碍儿童社区康复效果评价

了解社区康复在孤独症谱系障碍儿童中的作用,探索康复效果的相关影响因素,为更好地改善患儿的相关缺陷提供依据.方法 采用克氏孤独症行为量表(CABS)和儿童孤独症行为量表(ABC)进行筛查,采用精神疾病诊断和统计手册(第5版)(DSM-V)及儿童孤独症评定量表(CARS)进行诊断,选取参加了天津市孤独症谱系障碍儿童社区康复项目的8所幼儿园已完成《孤独症儿童发展评估表》1年3次完整评估的19例孤独症谱系障碍儿童,年龄为24~ 82个月,对其家长进行调查并收集相关信息.采用重复测量方差分析及Pearson线性相关分析进行统计处理.结果 孤独症谱系障碍儿童的8个领域3次评估的得分,每一次较前一次都有不同程度提高(P值均 <0.05).随时间递进的3次评估的康复效果实际年龄与各领域发展年龄的差值呈下降趋势,差异均有统计学意义(P值均 <0.05),且康复手段越多元、越有针对性,效果越好.发现疑似症状的年龄、最终确诊的年龄、首发语言的年龄、能独立行走的年龄、CARS智力功能得分、CARS总分与康复效果在不同领域之间存在统计学意义的相关性(P值均<0.05).结论 天津市的社区康复对孤独症谱系障碍儿童的预后有积极作用,具有针对性的长期系统综合干预的效果显著.     

本科护生心理弹性与专业适应性状况及其相关性分析

目的 调查本科护生心理弹性及专业适应性水平,探讨护生心理弹性与专业适应性相关性.方法 2019-12,选取天津医科大学护理学专业2016-2019级20个班级在校404名学生作为调查对象,均完成青少年心理弹性量表与大学生专业适应性量表的填写.结果 共发放问卷404份,剔除无效问卷后收回有效问卷392份.各年级护生之间心...     

重组天花粉蛋白体外诱导宫颈癌HeLa细胞p27基因去甲基化的研究

目的研究重组天花粉蛋白(recombinant trichosanthin,rTCS)对宫颈癌HeLa细胞中p27基因甲基化状态和基因表达的影响。方法应用不同质量浓度的rTCS(20、40、80μg/mL)处理体外培养的宫颈癌HeLa细胞后,MSP法检测用药前后细胞中p27基因的甲基化状态,Real-Ti me PCR法检测用药前后细胞中p27和DNA甲基转移酶-1(DNMT1)mRNA水平的变化,Western-blotting法检测用药前后细胞中p27蛋白表达的变化。结果HeLa细胞中p27基因为低表达,基因启动子区CpG岛呈部分甲基化状态。40μg/mLrTCS处理导致p27基因启动子区CpG岛去甲基化;在20、40、80μg/mL的rTCS作用48 h后,p27基因mRNA相对表达水平分别升高2.22、4.00、6.03倍,p27蛋白水平表达也逐渐增加;宫颈癌HeLa细胞中DNMT1 mRNA高表达,40μg/mLrTCS处理48 h可至DNMT1 mRNA表达水平降低78%。结论rTCS通过抑制DNMT1,逆转p27基因启动子区CpG岛的甲基化状态,使宫颈癌HeLa细胞中p27基因表达活化。rTCS能逆转宫颈癌HeLa细胞p27基因甲基化状态,调控p27基因和DNMT1的表达。     

缺失内质网驻留信号肽的小鼠钙网蛋白在B16-F1细胞中的表达

目的：克隆无内质网驻留信号肽的钙网蛋白（CRT）,构建表达分泌性钙网蛋白的B16-F1肿瘤细胞株.方法：以前期构建的小鼠钙网蛋白真核表达质粒为模板,采用突变PCR技术获得无内质网驻留信号肽的钙网蛋白cDNA并克隆入真核表达载体中.以脂质体转染法将该质粒转染B16-F1细胞后,用G418筛选单克隆细胞株.分别以PCR,WesternBlot法鉴定成功转染和表达分泌型CRT的B16-F1细胞株.流式细胞术分析该细胞株的细胞周期.结果：成功获得无内质网驻留信号肽编码序列的小鼠CRT真核表达质粒.稳定转染并筛选出表达分泌性钙网蛋白的B16-F1细胞株,CRT在此细胞株中表达并分泌至培养基质中.稳定转染前后的B16-F1细胞株细胞周期没有明显变化.结论：删除CRT编码序列中内质网驻留信号肽（KDEL）后,CRT失去了驻留在细胞内质网中的能力从而以分泌蛋白的形式出现在细胞外培养基质中.本研究为CRT的细胞外转移提供了一条新的途径,同时为以CRT为基础的抗肿瘤免疫研究提供了新的研究工具.