传代培养对基于肽质量指纹谱的细菌识别稳定性影响分析

目的 应用肽质量指纹谱技术对多次传代细菌进行识别,分析细菌传代对细菌识别能力的影响。方法 将幽门螺杆菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌分别连续传57、50、100代,金黄色葡萄球菌留取抗原。每一代新鲜培养菌和冻存抗原通过乙醇/甲酸法提取蛋白,采用肽质量指纹谱技术进行谱图采集和菌株鉴定。进一步采用NanoLC-MS/MS对幽门螺杆菌基于肽质量指纹谱识别的蛋白进行批量鉴定。结果 幽门螺杆菌、大肠埃希菌分别连续传57代和50代,采用肽质量指纹谱每代均能正确识别到种水平;金黄色葡萄球菌连续传100代,采用肽质量指纹谱每代新鲜菌株及冻存抗原均能正确识别到种水平,各代冻存抗原和新鲜菌株的肽质量指纹谱具有很好的一致性。幽门螺杆菌蛋白扫描分析,鉴定出206个蛋白,包括各种酶类（29.6%）、核糖体蛋白（15.5%）、外膜蛋白（10.7%）、假想蛋白（19.0%）、转运相关蛋白（2.0%）、其他蛋白（22.0%）。结论 细菌连续传代和抗原冻存不影响肽质量指纹谱对菌株的正确识别,细菌的肽质量指纹谱具有传代稳定性。     

马鞍山市金黄色葡萄球菌鉴定及SPA基因多态性分析

目的 鉴定分离自马鞍山的金黄色葡萄球菌,探索使用金黄色葡萄球菌SPA基因对菌株进行多态性分析.方法 采集马鞍山市食品、食物中毒和腹泻患者标本,按照GB/4789.10-2003和WS/T80-1996进行金黄色葡萄球菌的分离培养.对分离的菌株,用过氧化氢酶和血浆凝固酶试验后,用生化实验对菌株进行鉴定.提取鉴定为金黄色葡...     

北京市朝阳区2011年儿童A组溶血性链球菌超抗原基因的分子流行病学研究

目的 描述2011年北京市朝阳区儿童A组溶血性链球菌(GAS)的超抗原分子流行病学特征,分析超抗原基因与emm型别和GAS相关疾病的关系.方法 从猩红热、咽炎及扁桃体炎患儿的咽拭子分离培养获得71株GAS,应用PCR法检测这些GAS是否携带8类超抗原基因(speA、spel、ssa、speC、speJ、speG、spell和SMEZ);PCR扩增emm基因片段并测序,进行emm型别鉴定;分析超抗原基因、emm型别和GAS所致疾病之间的相互关系,应用,检验进行显著性分析.结果 71株GAS的超抗原基因检出率从高到低分别为speC(100.0％)、SMEZ(100.0％)、ssa(97.2％)、speG(95.8％)、speH(80.3％)、speI(80.3％)、speA(15.5％)和speJ(12.7％);71株GAS中检出emm12.0型菌株62株、emm1.0型7株、emm22.0型1株、emm75.0型1株;spel和spell基因与speA和speJ基因在emm12.0型与emm1.0型菌株中的分布差异有统计学意义(P均＜0.05);spel和spell基因在猩红热患儿和咽炎扁桃体炎患儿中的分布差异有统计学意义(P均＜0.05);未发现emm型别在不同的疾病中的分布有差异.结论 北京市朝阳区儿童携带的GAS超抗原基因的检出率与地域有一定关系;不同emm型别的GAS对超抗原基因的携带有一定的选择性,尤其是针对噬菌体携带的超抗原基因;较emm型别,超抗原基因能更好地建立菌株与疾病之间的关系.     

北京分离株金黄色葡萄球菌基因型分析

目的对2000-2005年北京分离株金黄色葡萄球菌进行基因分型研究,了解其型别构成特征。方法分别对48株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant S．aureus,MRSA）和3株甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（methicillin-sensitive S．aureus,MSSA）进行spa基因序列分析及脉冲场凝胶电泳（pulsed field gel electrophoresis,PFGE）分析,并与多位点序列分析（multi locus sequencing typing,MLST）进行比较。结果在MRSA中,t030和t037为主要spa型别,分别占47．92％（23／48）和37．50％（18／48）;t002只在2005年菌株中出现,占14．58％（7／48）。3株MSSA型别分别为t377和t304。PFGE按带型差异及相似度分析,将所有菌株分为5组11型。结论t030和t037是MRSA临床分离株中的spa优势型别,A组和D组为PFGE优势型别。合理使用MLST、PFGE和spa分型方法对我国MRSA防治具有重要意义。     

霍乱弧菌山梨醇发酵相关基因序列特征分析

目的 比较霍乱弧菌流行株与非流行株山梨醇发酵相关基因的差异，为采用分子生物学方法快速区分两类菌株提供理论依据。方法采用基因测序的方法，分别对42株霍乱弧菌(01群埃尔托型33株、0139群9株)流行株和非流行株的糖发酵激活蛋白、外周质麦芽糖结合蛋白、外周质磷酸盐结合蛋白和外周质氨基酸结合蛋白编码基因进行序列比较。结果糖发酵激活蛋白编码基因在霍乱弧菌流行株与非流行株共发现三个位置有单个碱基的差异，即第106、150和378位核苷酸(在流行株分别为A、A和T，而在非流行株分别为G、G和C)。第106位碱基的差异导致了氨基酸的不同(编码蛋白的第36个氨基酸在流行株和非流行株分别为苏氨酸和丙氨酸)。外周质麦芽糖结合蛋白和外周质磷酸盐结合蛋白编码基因各发现两个碱基的规律变化，外周质氨基酸结合蛋白编码基因未发现一致性碱基改变。结论在这些基因中存在着多个单核苷酸多态性，可能会成为快速区分两类菌株的重要依据。糖发酵激活蛋白第36位氨基酸的改变，可能会引起该蛋白活性的改变。     

重组缩短的葡萄球菌类肠毒素X蛋白克隆表达及催吐活性评价

目的 分析缩短的葡萄球菌类肠毒素X(truncated Staphylococcal enterotoxin-like toxin X,tSElX)氨基酸多态性,对其进行克隆表达纯化并对催吐活性进行评价。方法 将tselx序列与本课题组前期完成测序的145株CC398菌株基因组序列及NCBI数据库进行比对分析。设计引物扩增tselx目的基因,将该片段重组于pMD18-T载体中并进行测序鉴定。经限制性内切酶BamHⅠ和EcoR Ⅰ双酶切后将目的片段构建于质粒pGEX-6P-1及pET-28a(+)中,重组质粒鉴定后,IPTG诱导蛋白表达。将以包涵体形式表达的蛋白进行变性和复性,用亲和层析法和超滤法对表达产物进行纯化。将纯化的tSElX蛋白以250 μg/kg喂饲普通狨猴,观察呕吐反应。结果 tselx基因在我国不同来源(患者、健康人群和动物)的145株CC398菌株均存在。我国菌株编码蛋白的氨基酸序列同源性为100.0%,与4株美国菌株的同源性分别为97.8%(1株)和98.9%(3株)。通过两套表达系统及不同诱导条件,tSElX均以包涵体形式表达。通过变性及复性,获得高纯度的可溶性重组蛋白tSElX。在250 μg/kg剂量下tSElX蛋白不能引起普通狨猴的呕吐反应。结论 tSElX氨基酸序列在CC398菌株中普遍存在,且具有一定保守性。高纯度的可溶性tSElX重组蛋白在250 μg/kg剂量下不具有普通狨猴催吐活性。     

金黄色葡萄球菌类肠毒素W的超抗原活性位点预测与克隆表达

目的预测金黄色葡萄球菌类肠毒素W(SElW)与T细胞受体(TCR)的对接和超抗原活性位点, 并对SElW进行克隆表达和纯化。方法利用AlphaFold对SElW蛋白单体进行三维结构预测, 借助SAVES在线服务器使用ERRAT、拉氏图和Verify₃D等软件对蛋白模型进行评估。用ZDOCK服务器模拟SElW与TCR的对接构象, 并对SElW与其他肠毒素的氨基酸序列进行比对。设计引物扩增selw基因, 将该片段重组于pMD18-T载体中并进行测序;经限制性内切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ双酶切后将目的片段重组于表达质粒pET-28a(+)中, 重组质粒鉴定后用IPTG诱导表达;用亲和层析法对表达于上清中的SElW蛋白进行纯化, 用BCA法对蛋白进行定量。结果三维结构预测结果显示, SElW蛋白由氨基末端和羧基末端两个结构域组成, 其中氨基末端结构域由3个α-螺旋和6个β-片层组成, 羧基末端结构域由2个α-螺旋和7个反向平行的β-片层组成。SElW蛋白模型的整体质量因素得分为98.08, 其中93.24%的氨基酸Verify₃D得分≥0.2, 且...     

Claudin在幽门螺杆菌和AGS细胞相互作用不同时间点表达分析

目的研究Claudin家族成员在Helicobacterpylori（H．pylori）和AGS相互作用的不同时间点表达谱变化。方法TRIzol方法提取H．pylori26695攻击AGS细胞0、0．5、2、4、6h时间点的细胞总RNA样品，对样品mRNA进行线性扩增后，应用IlluminaHuman-6芯片检测基因表达量，以DetectionScore≥0．99；IDiffScoreI≥13；方差分析（ANOVA）P≤0．05作为筛选差异基因的标准；比较Claudin家族成员的表达量．结果Claudin家族有4个成员存在差异表达，其中在早期Claudin15下调，4h后无差异，Claudin2、23早期上调后于4h和6h分别恢复至无差异水平，而Claudin6在0．5h后持续上调。结论Claudin蛋白家族2、6、15、23成员参与H．pylori感染过程，并且呈现时序性变化，为H．pylori感染能引发胃癌机制研究提供线索。     

BIOMIC药敏分析系统对最小抑菌浓度判读能力的评价

目的评价BIOMIC药敏分析系统对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant IS.aureus,/IMRSA)最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration,MIC）的判读能力。方法用纸片扩散法检测50株MRSA对10种抗生素的敏感性,用BIOMIC药敏分析系统进行结果判读,与Etest结果进行比较,WHONET 5.4为分析软件。用BIOMIC推算的MIC值与Etest测得值的比值（BIOMIC MIC/Etest MIC）进一步比较两种方法测得的MIC一致性。结果两种方法测得庆大霉素结果( S、I、R)的一致率为98.00%,次要误差率为2.00%,其余抗生素结果( S、I、R)的一致率为100%。BIOMIC MIC/Etest MIC 比值分析结果为,MIC总一致率为83.92%。 结论BIOMIC分析系统和Etest方法对于检测MRSA具有较好一致性,尤其是药物敏感菌株,可以用于临床检测或耐药监测的初步判定。