p21WAF1/GIP1基因转染人宫颈癌Hela细胞对顺铂敏感性的影响

目的 探讨转染p21^WAF1／GIP1基因（p21基因），对宫颈癌Hela细胞生长抑制作用及p21基因转染Hela细胞对顺铂敏感性的影响。方法 应用脂质体转染技术，将质粒peDNA3转入人宫颈癌Hela细胞中，经G418筛选，转染阳性克隆细胞连续传代培养，并采用中性红摄入法测定顺铂对p21基因转染人宫颈癌Hela细胞增殖抑制作用，流式细胞仪（FCM）检测细胞周期变化。结果 经G418筛选，Hela细胞全部死亡，转染质粒peDNA3的Hela细胞存活，并可连续传代。p21基因转染后，细胞生长明显受到抑制，细胞周期停滞于G1期，与对照组相比，细胞周期G1期比例明显增加。同时p2l表达阳性的Hela细胞对顺铂敏感性增强。结论 p2l基因转染能使Hela细胞出现生长抑制并对顺铂化疗作用敏感性明显增强。     

与人体肥胖相关的神经肽Y受体Y1基因的克隆及序列分析

目的 克隆与肥胖相关的人神经肽Y受体Y1(NPYlR)基因,并鉴定该克隆基因序列的正确性.方法 从人的脂肪组织中提取总RNA并进行反转录,以此为模板用PCR扩增NPY1R基因的cDNA,然后与pET 28a+载体重组,筛选阳性克隆和DNA序列分析鉴定,测序后与GeneBank中NPY1R基因进行同源性比较和序列分析.结果 PER扩增出一个1100 bp左右的DNA片段,与载体重组后DNA序列分析鉴定,DNA序列分析显示克隆的DNA片段是人NPY1R基因,且所克隆的基因共编码384个氨基酸,分子量为44 KD,与GeneBank中NPY1R基因序列同源性达100%.结论 克隆的人NPY1R基因与GeneBank中NPY1R序列完全一致,为进一步应用分子生物学技术深入研究NPY1R与人体肥胖发生、发展及转化等相关作用机制及应用该基因进行其基因蛋白表达奠定了基础.     

CD200基因重组质粒延长异基因小鼠皮肤移植物存活的实验研究

目的:利用小鼠同种异体皮肤移植模型,观察重组基因CD200的抗排斥作用。方法:用肌肉注射并电转染的方法,将pcDNA3-CD200基因重组质粒100μg转染到受者BALB/c小鼠体内,同日进行皮肤移植,记录移植皮片的存活时间,采用RT-PCR和免疫荧光的方法检测CD200基因在受者体内的转录和表达,用HE染色观察移植皮片组织病理改变情况。用MTT法检测受鼠对供鼠及第三方供鼠的单向混合淋巴细胞反应(MLR)。结果:RT-PCR和免疫荧光检测表明,肌肉注射并电转染pcDNA3-CD200基因重组质粒后,可在肌肉组织中检测到CD200基因的转录和表达。空白对照组移植皮片平均存活时间为(8·67±1·75)天,pcDNA3空质粒组移植皮片平均存活时间为(8·00±1·55)天,pcDNA3-CD200组小鼠移植皮片平均存活时间为(11·78±1·86)天,移植皮片的存活时间显著延长(P<0·05);pcDNA3-CD200组移植皮片内浸润的炎细胞数量明显减少;MLR检测表明pcDNA3-CD200组的BALB/c小鼠对C57BL/6供鼠的MLR明显低于空白对照组(15天时0·11±0·02低于0·19±0·03,P<0·05),对第三供鼠的MLR也相似。结论:肌肉注射并电转染pcDNA3-CD200基因重组质粒可在小鼠体内大量转录和表达并延长了皮肤移植物的存活时间,减少移植物内炎细胞浸润,降低混合淋巴细胞反应,具有显著的抗排斥作用。     

血清TK1压电石英晶片免疫传感器测定法的建立及其在恶性肿瘤诊断中的初步应用

目的建立压电石英晶片免疫传感器测定方法检测人血清中胸腺嘧啶脱氧核苷激酶-1(TK1),探索其对常见恶性肿瘤早期诊断的可行性。方法克隆人TK1基因,表达并纯化TK1基因融合蛋白,再制备并纯化TK1单克隆抗体后,用生物素标记TK1单克隆抗体。再选择并利用特殊TK1固化剂和镀金压电石英晶体制备压电石英晶体TK1免疫传感器及抗干扰反应池及屏蔽系统。最后,用此免疫传感器方法检测正常人、不同肿瘤患者血清。结果肝癌血清的TK1水平最高(2·44±0·46)ng/ml,其次为乳腺癌血清(1·16±0·24)ng/ml,二者的TK1水平均明显高于其他恶性肿瘤血清(P<0·001)。肺癌、胃肠癌、生殖系统癌以及其他恶性肿瘤血清间的TK1水平接近(P>0·05),但与良性肿瘤血清TK1存在显著性差异(P<0·001)。此外,良性肿瘤血清的TK1频移值亦显著大于正常人血清(P<0·001)。结论压电石英晶片免疫传感器可作为一种简便灵敏TK1测定新方法用于临床恶性肿瘤普查以及区分肿瘤类型,尤其是肝癌的诊断。     

老年肿瘤病人短寿命抑制细胞功能及T细胞亚群的研究

本文对健康成年人(20例)、健康老年人(46例)、老年肿瘤病人(21例)进行短寿命抑制性T细胞(Ts)功能及T细胞亚群数量和功能的研究,探讨老年肿瘤病人细胞免疫功能的变化。结果表明,健康老年人Ts抑制指数明显高于成年人(P<0.05),老年肿瘤病人Ts抑制指数明显高于健康老年人(P<0.05)。老年肿瘤病人OKT_3~ 细胞百分率降低,与健康成年人组比较有显著差异(P<0.01);OKT_4~ 细胞百分率下降,而OKT_8~ 细胞百分率上升,与成年组比较均有显著差异,并且OKT_4~ /OKT_8~ 比值显著降低。提示老年人及老年肿瘤病人细胞免疫功能低下。     

p27kip1基因克隆及其对人舌癌细胞生长的影响

目的 将克隆的人p27^kip1 cDNA构建真核表达载体并进行基因转染，研究其对人舌癌细胞生长的影响。方法 从正常组织中克降人p27^kip1基因连接至pcDNA3真核表达载体上，应用脂质体将重组质粒转染人舌癌Tca8113细胞中，用c418筛选抗性细胞克隆，观察外源目的基因在靶细胞中的整合及表达以及转染与未转染细胞的生长情况。结果 成功克隆p27^kip1cDNA并构建p27^kip1直核表达载体，将其导入Tca8113细胞中，经G418筛选得到稳定表达p27^kip1基因的细胞株，其细胞的生长受到抑制，增殖下降。结论 p27^kip1基因具有抑癌基因的作用，在体外转染Tca8113细胞并高表达p27^kip1抑制了舌癌细胞增殖。为进一步研究p27^kip1基因治疗奠定了基础。     

IFN-γ治疗结核的动物实验研究

目的　探讨 IFN- γ对结核的治疗作用。方法　在建立小鼠结核模型的基础上 ,给予小鼠 IFN- γ腹腔内注射 ,采用 RT- PCR法观察小鼠肺组织 IFN-γ的表达 ,病理切片及肺组织内结核菌培养的对比。结果　给予 IFN-γ注射的小鼠病理组织像上也可见结核肉芽肿样病变 ,但对照组织病理切片上可见在渗出病变的基础上 ,出现灶性坏死。两组病变对比出现明显的差异。肺内细菌数也呈现明显的对比。IFN- γ的 m RNA表达 ,实验组较对照组明显减少。结论　 IFN-γ是一个有效的增强宿主抵御结核分支杆菌感染的免疫调节细胞因子。     

p21基因转染人肝癌SMMC-7721 细胞对化疗药物敏感性的研究

目的探讨p21基因转染人肝癌SMMC-7721细胞（7721细胞）对化疗药物的敏感性，深入研究p21基因对肝癌细胞的治疗作用。方法应用磷酸钙介导p21基因转染人肝癌7721细胞；通过G418筛选稳定表达细胞株并扩大培养；采用MTT法检测肿瘤细胞增殖速度；流式细胞术检测细胞周期变化。结果经过3～4w G418筛选得到稳定表达的细胞株，p21基因稳定转染并联合化疗药物应用可明显抑制7721细胞的体外增殖，细胞周期明显改变，细胞从G1期到G2期发生阻滞。结论提示转染外源p21基因联合化疗药物可使7721细胞周期阻滞于G1期，并可抑制肿瘤细胞增殖。     

人细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)基因克隆和原核表达

目的从人胃癌组织中克隆出人CDK2基因和原核表达CDK2蛋白.方法从胃癌组织中提取RNA,逆转录PCR扩增CDK2 cDNA'PCR产物进行TA克隆和DNA序列分析;阳性TA克隆CDK2片段亚克隆入PET28a 载体,IPTG诱导表达人CDK2.结果逆转录PCR扩增出约900 bp的DNA片段,TA克隆和DNA序列分析显示重组片段是人CDK2基因序列,全长897bp;CDK2 cDNA亚克隆入PET28a 载体NcoI和XhoI位点之间;IPTG诱导出约34 kD的蛋白.结论从人胃癌组织中成功地扩增出人CDK2基因,并且在大肠杆菌中得到表达.     

重组人神经肽Y受体Y1融合蛋白的表达、纯化及其生物信息学分析研究

目的 在大肠杆菌中表达人神经肽Y Y1受体,并对之进行纯化、鉴定及生物信息学分析.方法 取已构建好且经测序确认无误的重组质粒pET28a-Y1转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白,并经SDS-PAGE检测和Western Blot鉴定,表达产物包涵体经Ni2+-NTA亲和层析纯化.然后利用相关在线软件进行生物信息学分析Y1受体蛋白.结果 经IPTG诱导含有pET28a- Y1重组质粒的DE3菌,表达出重组人Y1融合蛋白.重组蛋白经Ni2+-NTA亲和层析进行纯化后,得到了较高纯度的融合蛋白.经相关在线软件分析后获得了Y1受体的相关生物学特性.结论 重组质粒pET28a-Y1在大肠杆菌DE3中成功表达,亲和层析纯化后获得较高纯度融合蛋白,并对Y1受体蛋白的生物学特征进行了预测,为进一步研究其生物学功能及其抗体的研制奠定了基础.