STAT3真核表达质粒的构建及对胃癌细胞增殖的影响

目的 构建人信号转导和转录激活因子3（STAT3）真核表达载体,研究STAT3基因对人胃癌细胞株MGC803的影响。方法 构建pcDNA3-STAT3真核表达质粒,经脂质体介导转染胃癌细胞株MGC803。RT-PCR和Western blotting检测转染后STAT3、P-STAT3(Y705)、P-STAT3(S727)、Survivin 和 PCNA在MGC803细胞中mRNA和蛋白水平的表达,CCK-8法检测pcDNA3-STAT3对细胞MGC803的影响。结果 测序及酶切鉴定证实,真核表达质粒pcDNA3-STAT3构建成功。Western blotting和RT-PCR实验结果证实,与转染空载体组相比,转染重组质粒组STAT3、P-STAT3(Y705)、P-STAT3(S727)、Survivin 和 PCNA在蛋白水平和mRNA水平的表达均明显升高,差异有统计学意义（P＜0.05）。CCK-8实验结果显示,与转染空载体组相比,转染重组质粒组人胃癌细胞株MGC803增殖能力明显升高,差异有统计学意义（P＜0.05）。结论 真核表达质粒pcDNA3-STAT3可以提高STAT3基因在人胃癌细胞株MGC803中的表达,并且增强胃癌细胞的增殖能力。     

DEC1和STAT3在胃癌组织中的表达及意义

目的:探讨DECl和S1-AT3在胃癌组织中的表达及其在胃癌发病机制中的作用.方法:利用免疫组织匕学方法检测59例胃癌组织中DEC1、STAr3 2种蛋白的表达情况,以19例癌旁正常组织作为对照.结果:DECl蛋白在胃癌组织中的阳性表达率为71.2%,高于癌旁正常组织的阳性表达率(26.3%.P<0.05).胃癌组织中的DECl表达与STAT3表达呈正相关,与肿瘤的分化程度有关,但与患者性别、年龄、肿瘤大小、TNM分期、浸润深度、有无淋巴结转移及远处转移无关;STAT3蛋白的表达与肿瘤的TNM分期、分化程度、浸润深度、淋巴结转移有关,而与患者性别、年龄、肿瘤大小及远处转移无关.结论:DEC1蛋白在胃癌组织中高表达,且与STAT3蛋白的表达相关.DECl和STAT3均为转录调节因子,二者的相互调节很可能在胃癌的发生发展中具有重要作用.     

甲胎蛋白特异性小干扰RNA重组腺病毒载体的构建

背景：RNA干扰技术的应用，关键在于能够采用1个有效的基因转移系统将小干扰RNA转入至靶细胞，目前广泛应用的是构建小干扰RNA表达载体。 目的：利用AdMax腺病毒载体系统构建表达人甲胎蛋白-小干扰RNA的腺病毒载体。 设计、时间及地点：开放性实验，于2007-03/10在山东大学附属济南市中心医院中心实验室完成。 材料：穿梭质粒pDC316-EGFP-U6为本元正阳基因技术公司产品；AdMax KitD试剂盒与低代数HEK293细胞为Microbix Biosystems Inc.（Canada）公司产品。 方法：选择针对甲胎蛋白 mRNA的特异性小干扰RNA靶序列，设计合成为相应的双链DNA，并将其与酶切线性化的pDC316-EGFP-U6载体片段连接，构建好的穿梭质粒pDC316-EGFP-U6-AFP-siRNA和腺病毒骨架质粒pBHGlox_E1,3Cre共转染HEK293细胞，同源重组产生重组腺病毒。 主要观察指标：对重组腺病毒进行聚合酶链反应鉴定及扩增、纯化、滴度测定。 结果：构建的穿梭质粒载体经聚合酶链反应鉴定和测序分析，证实与设计一致。重组腺病毒Ad-AFP-siRNA经聚合酶链反应和绿色荧光蛋白表达检测证实构建成功，测定滴度为1.4×109 nfu/L。 结论：实验成功构建了Ad-EGFP-U6-AFP-siRNA重组腺病毒。     

FUT3-miRNA重组质粒对人胃癌KATO-III细胞增殖的影响

目的:研究利用miRNA干扰技术抑制FUT3基因表达对人胃癌KATO-Ⅲ细胞增殖的影响.方法:将前期实验构建成功的2对针对FUT3基因的特异性miRNA表达载体,用脂质体转染入人胃癌KATO-Ⅲ细胞,RT-PCR检测FUT3基因表达水平的变化;免疫细胞化学法、流式细胞术检测其合成抗原sLeA表达变化;MTT法、克隆形成实验检测FUT3基因的表达抑制对KATO-Ⅲ细胞增殖的影响.结果:转染FUT3-miRNA的2个干扰组FUT3基因mRNA相对表达量分别为0.41±0.01,0.36±0.02,明显低于对照组(0.71±0.05)和空载体组(0.65±0.03,P<0.05);细胞表面合成抗原sLeA的表达水平,FUT3-miRNA1组为35.51%±0.36%,FUT3-miRNA2组为26.05%±1.14%,明显低于对照组(52.79%±2.62%)与空载体组(49.75%±1.29%,P<0.05);与对照组(5.60%±0.63%)和空载体组(8.90%±0.91%)相比较,FUT3-miRNA1组(38.10%±1.96%)和FUT3-miRNA2组(49.04%±2.37%)能明显抑制细胞的增殖(P<0.05);细胞的克隆形成能力FUT3-miRNA1组(14.10%±1.70%)和FUT3-miRNA2组(12.50%±1.96%),显著低于对照组(29.79%±3.05%)和空载体组(28.92%±2.10%,P<0.05).结论:FUT3靶向miRNA真核表达载体可有效抑制胃癌细胞的增殖能力.     

分化型胚胎软骨发育基因1特异性小干扰RNA表达质粒的构建和鉴定

背景:分化型胚胎软骨基因1 可调控肿瘤生长、凋亡、衰老相关因子,与肿瘤的发生发展有着重要的联系.目的:构建针对人分化型胚胎软骨基因1 的小干扰RNA 表达载体.方法:从NCBI 中查找人分化型胚胎软骨基因1 基因全长mRNA 序列,利用Katahdin 提供的在线小干扰 RNA 模板序列设计软件,设计针对分化型胚胎软骨基因1 的2 条shRNA 的 DNA 模板单链,合成靶向分化型胚胎软骨基因1 基因转录可形成茎环结构的寡聚核苷酸,退火后与酶切后的pGreenPuro.shRNA Cloning and Expression Lentivector 质粒连接,在JM-109 菌株中扩增,并进行质粒DNA 琼脂糖凝胶电泳分析、紫外分光光度计检测、菌落PCR 以及测序鉴定.结果与结论:将含有分化型胚胎软骨基因1 目标序列25 bp 的双链 DNA 插入片段,连接到pGreenPuro.shRNA Cloning and Expression Lentivector 质粒形成重组质粒.质粒DNA 琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计分析结果确认所提质粒纯度较高,可用于后续实验.菌落PCR 结果表明产物大小约为170 bp,与预期相符.测序结果表明pGreenPuro.shRNA Cloning and Expression Lentivector 质粒已经插入人分化型胚胎软骨基因1 的干扰合成片段,无碱基突变.成功构建了靶向分化型胚胎软骨基因1-小干扰 RNA 表达载体.