DMRIE-C、Lipofectamine2000和TransMessenger转染HCV RNA效率比较

目的比较和优化DMRIE-C、Lipofectamine2000和TransMessenger3种转染试剂的转染效率,选择适合建立丙型肝炎病毒（HCV）复制子或感染克隆的转染试剂和条件。方法将含有萤火虫荧光素酶报告基因的HCVRNA,分别通过上述3种转染试剂转染Huh7和Huh7.5.1细胞系,于转染24h后裂解细胞,测定荧光素酶活性。2~3周后,结晶紫染色细胞集落。结果在Huh7和Huh7.5.1细胞中,DMRIE-C比Lipofectamine2000和TransMes-senger的转染效率高。在Huh7细胞中,4μlDMRIE-C转染试剂组的荧光素酶活性比其他组高（P〈0.05）。在Huh7.5.1细胞中,3μlDMRIE-C转染试剂组的荧光素酶活性比其他组高（P〈0.05）。在细胞集落形成实验中,DMRIE-C组的细胞克隆数多于其他两种转染试剂组。结论在Huh7和Huh7.5.1细胞中,DMRIE-C比Lipo-fectamine2000和TransMessenger的转染效率高。当建立HCV复制子或感染克隆试验时,既要选择合适的RNA转染试剂,又要考虑细胞生长状态的影响。     

cDNA-RDA技术分离新的肝硬化相关基因片段

目的：分离在肝硬化组织上调表达的新基因，以阐述肝硬化发生的分子机制。方法：利用优化的代表性差异分析方法分析正常肝脏及肝硬化组织表达基因的差异。两轮杂交后的产物克隆到T栽体中，斑点杂交筛选阳性克隆以获得差异表达基因片段，并进一步以半定量RT-PCR鉴定。结果：上调表达的克隆包括与一些序列和功能完全未知的基因同源的cDNA以及未曾报道过的在肝脏病变中发生表达变化的已知基因——钙结合酪氨酸磷酸化调节蛋白、雌激素应答B盒蛋白等。结论：利用优化的代表性差异分析方法成功分离获得在肝硬化组织中上调表达的基因片段，其中一些新基因的克隆及其在肝硬化发生中的作用有待进一步研究。     

肝脏高效表达调控元件的构建及其表达效果的鉴定

目的：构建一种肝脏高效表达调控元件，促进水动力转染外源基因在体内的长期高效表达。方法：构建了以hAAT基因作为报告基因，分别含有表达调控元件AerApoEAATP、ApoEAATP、AIbEAATP及CMV启动子的真核表达载体pCIneo-AerApoEAATP—hAAT、pCIneo-ApoEAATP-hAAT、pCIneo-AlbEAATP-hAAT及pCIneo-hAAT．水动力转染法将上述质粒分别转染BALB／c小鼠，定期检测小鼠血清中hAAT的浓度反应AerApoEAATP、ApoEAATP、Al-bEAATP及CMV的调控能力。结果与结论：所构建的表达调控元件AerApoEAATP具有较强的调控能力，其长期的调控水平高于CMV、AlbEAATP和ApoEAATP。     

乳腺柱状细胞病变的临床病理观察

<正>由于乳腺X线照相普查能检测到微钙化灶的存在，目前临床发现越来越多的柱状细胞病变(columnar cell lesions, CCL)。CCL包括柱状细胞改变(columnar cell change, CCC)、柱状细胞增生(columnar cell hyperplasia, CCH)和乳腺平坦型上皮非典型增生(flat epithelial atypia, FEA) ^[1-2]。     

脂联素在小鼠肝脏的高效稳定表达

目的：获得小鼠脂联素（adiponectin，ADPN）在肝脏的高效稳定表达，方法：构建含肝脏特异性启动子hAATp和增强子ApoEHCR的小鼠脂联素基因（mAd）的真核表达载体pAA-neo-mAd。以绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）为报告基因证明该载体在COS-7细胞中表达后，流体动力法（hydrodynamics-based procedure）通过尾静脉注射将其导入小鼠肝脏。通过肝脏mAdmRNA定量（半定量RT-PCR法）、免疫组织化学检测及血清脂联素水平测定（定量ELISA法）鉴定脂联素在肝脏的表达及表达效率。结果：肝组织RT—PCR的结果显示，注射后12h肝脏内即可检测到mAd mRNA的表达，且能持续表达6周以上。24h后血清脂联素水平显著升高，48h达到峰值，一直持续6周后仍明显高于正常水平。肝脏脂联素免疫组化染色呈阳性。结论：流体动力法能有效地将质粒载体pAA-neo-mAd导入小鼠肝脏，并能在小鼠肝脏高效稳定地表达重组小鼠脂联素。     

人CD81分子的肝组织特异性稳定表达

目的：用肝组织特异性启动子，实现人CD81分子在小鼠肝癌细胞Hepa 1—6中的稳定表达。方法：从能感染丙型肝炎病毒(HCV)的人肝癌细胞系HepG2中提取RNA，用随机引物合成cDNA的第1条链，然后用人CD81基因的特异性引物进行PCR扩增，克隆PCR扩增片段。将经测序证明为人CD81基因的正确序列，连接到肝特异性启动子的下游，使CD81基因的3′端与SV40polyA加尾序列融合，得到肝组织特异性表达的人CD81融合基因片段。将该融合基因插入真核表达载体pcDNA3中，转染小鼠肝癌细胞系Hepa 1—6。经G418加压筛选后，分别用RT—PCR检测人CD81 mRNA的转录，用FACS检测人CD81蛋白的表达。结果：克隆序列的测序结果与GenBank中登录的序列进行对比表明，得到了人CD81 cDNA的正确序列。构建的人CD81肝特异性融合基因片段可稳定转染Hepa 1-6细胞，并可检测到人CD81在mRNA水平上的转录和在蛋白质水平上的稳定表达。结论：由于CD81是HCV的感染受体，稳定表达HCV感染受体-人CD81分子的小鼠肝癌细胞克隆的获得，为今后研究HCV包膜蛋白与CD81的相互作用、筛选感染阻断药物，以及发展HCV感染的小鼠动物模型奠定了基础。