Analysis of Specific Th1/Th2 Helper Cell Responses and IgG Subtype Antibodies in Anti-CD4 Monoclonal Antibody Treated Mice with Autoimmune Cardiomyopathy

The cytokine repertoire of ADP/ATP carrier-specific humoral immune responses and the cytokine-dependent anti-ADP/ATP carrier antibody IgG subclasses were examined in a cohort of ADP/ATP carrier-immunized BALB/c mice treated with anti-CD4 monoclonal antibody. Eighteen male BALB/c mice （6–8 weeks old） were randomized into 3 groups： dilated cardiomyopathy （DCM） group, DCM-tolerance （Tol） group and control group. The mice in DCM group were immunized with the peptides derived from human ADP/ATP carrier protein for 6 months and mice in the control group were sham-immunized, while the mice in DCM-Tol group were immunized with ADP/ATP carrier protein and anti-CD4 McAb simultaneously. Serum autoantibody against ADP/ATP carrier and IgG subclasses were measured by ELISA, intracellular cytokines IFN-γ and IL-4 of Th cells were moni- tored with flow cytometry, and splenic T cell cytokines IFN-γ, IL-2, IL-4 and IL-6 were detected by using real-time fluorescent quantitative PCR. The results showed that the autoantibody against ADP/ATP carrier was found in all mice in DCM group, and the antibody level, serum IgG1 and IgG2a subclasses, cytokines in T cells and Th cells were all elevated in DCM group, as compared with those in control group （P〈0.01）. On the other hand, in DCM-Tol group, the autoantibody level and contents of all the cytokines were significantly different from those in DCM group （P〈0.01）, and were close to those in control group. And the levels of IgG1, IgG2a, IgG2b and IgG3 were influenced, to varying degrees, by anti-CD4 McAb as compared with those in DCM group. All these four types of IgG subclasses were substantially decreased in DCM-Tol group as compared with DCM group. It is concluded that the treatment with anti-CD4 McAb could prevent the activation of T cells, reverse the abnormal secretion of cytokines and the imbalance between Th1/Th2 cell subsets and abnormal production of autoantibody against ADP/ATP carrier, and eventually avoid myocardial injuries.     

构建一种高产量小胶质细胞体外纯化培养的方法

背景：小胶质细胞在一些神经系统疾病如帕金森病、阿尔茨海默病中有重要作用。体外原代培养是进行小胶质细胞功能研究的基础，但目前常用的一些经典培养方法存在步骤繁琐、产量过低的问题。目的 建立一种简易高产量的原代小胶质细胞体外纯化培养方法。设计：以细胞为单一样本的探索性研究。单位：华中科技大学同济医学院附属协和医院神经内科。材料：实验于2004-04／10在协和医院中心实验室完成，新生(出生ld)昆明小鼠10只，雄性。方法：改进的培养方法以McCarthy等的经典培养方法为基础，通过提高初次接种密度。减少细胞离心过滤过程，进行不换液的营养缺失培养等重要改进，并使用低浓度胰酶一乙二胺四乙酸消化法分离纯化小胶质细胞，经MAC-1抗体免疫化学染色标记，计算MAC-1抗原阳性细胞，观察小胶质细胞培养的产量和纯度。主要观察指标：①倒置显微镜观察小胶质细胞形态。②免疫组织化学鉴定比较两种方法下小胶质细胞纯度、激活状态。结果：经典的McCarthy培养方法小胶质细胞培养周期为20d，产量为2&;#215;10^5个／瓶，细胞纯度为95％～97％；改进的方法小胶质细胞培养周期为15d，产量为1&;#215;10^6个／瓶，得到的小胶质细胞纯度为96％～98％。与经典的McCarthy培养方法比较，改进的方法周期短，产量提高了3～10倍。两种方法培养的小胶质细胞纯度和细胞激活状态没有明显差别。结论：新方法得到的小胶质细胞纯度与激活状态均与经典方法相似，但由于其步骤简单，周期短和有效提高了培养产量，为进行小胶质细胞功能特性以及在神经修复中作用的深入研究提供了良好的方法学基础。     

ELISA及免疫印迹法检测抗肌球蛋白抗体的比较

目的 比较ELISA和免疫印迹法检测抗肌球蛋白抗体的优缺点和临床应用价值。方法 采用猪心肌组织中提取的心肌肌球蛋白作抗原,以ELISA和免疫印迹法检测48例扩张型心肌病（DCM）和40例冠心病患者血清中的抗肌球蛋白抗体;同时与人工合成的肌球蛋白重链抗原对比。结果 ELISA和免疫印迹法对DCM组抗肌球蛋白抗体检测的阳性率相近（50％对43．8％）,但后者能区分针对抗原亚单位的抗体,前者则不能。猪心肌肌球蛋白与人工合成多肽的ELISA检测结果具有高度的相关性（P＜0．01）。结论 以人工合成肌球蛋白重链作抗原,采用ELISA检测抗肌球蛋白抗体既有助于DCM与冠心病的鉴别诊断,又简便易行。     

AT1-受体多肽诱导大鼠免疫损伤反应及其药物干预的研究

目的探讨AT1-受体多肽诱导大鼠的免疫反应和药物干预效果.方法 30只雄性大鼠分为三组免疫组(Immunity,Im)和免疫加药物(AT1-受体拮抗剂-科素亚)干预组(Immunity+Losartan,Im-L)各12只,以每只150 μg AT1-受体细胞外第二带合成肽剂量与载体牛血清白蛋白偶联后加上福氏佐剂免疫大鼠;对照组(Control)6只,假性免疫,"免疫液"与免疫组一样,但不含有AT1-受体细胞外第二带合成多肽.采用尾套法检测大鼠鼠尾收缩血压(SBP)和心率(HR);ELISA法检测血清抗AT1-受体细胞外第二带合成肽抗体;观察心脏、肾脏、脑和腹主动脉组织光镜和心脏、肾脏组织电镜的病理变化以及心脏、肾脏重与体重比值;试验期12周.结果 Im-L组大鼠鼠尾收缩血压明显下降,与Control组和Im组有显著性差异;鼠心率、光镜病理和心脏、肾脏重与体重比值三组间比较未见明显差异;Im和Im-L组有抗AT1-受体细胞外第二带合成肽抗体产生,其O.D值明显增高,与被免疫前比较有显著性差异(P<0.01),Im和Im-L组阳性检出率高达100%;电镜检测在Im组可见左室心肌细胞线粒体增多、肿胀,嵴溶解消失,基质密度明显降低,甚至呈囊泡状,肌丝排列不整,肌原纤维溶解、断裂以及在肾脏组织见肾小管上皮细胞内溶酶体增多;电镜检测在Im-L组也可见左室心肌细胞损害但较Im组明显减轻;在Control组则未观察到明显的组织细胞损害改变.结论 AT1-受体细胞外第二带多肽可以诱导大鼠产生抗AT1-受体细胞外第二带多肽抗体并导致心肌和肾脏组织的免疫损伤;科素亚具有阻滞抗AT1-受体细胞外第二带多肽抗体导致组织免疫损伤的作用和组织保护效应.     

肠病毒感染及抗ADP/ATP载体抗体在病毒性心脏病发病中的意义

目的 :探讨肠病毒感染与抗二磷酸腺苷 /三磷酸腺苷 (ADP/ ATP)载体抗体在病毒性心脏病发病中的意义。方法 :应用逆转录聚合酶链式反应 (RT- PCR)和免疫转印法对临床诊断为病毒性心肌炎 (VMC)和扩张型心肌病 (DCM)患者进行肠病毒核糖核酸 (RNA)及抗 ADP/ ATP载体抗体的检测。结果 :RT- PCR方法检测肠病毒 RNA,VMC组 (n =74) 4 2例 (56.8% )阳性 ,DCM组 (n=2 6) 1 1例 (42 .3% )阳性。与健康组 (n =30 )比较具有显著性差异 (分别 P <0 .0 1 ,P <0 .0 5) ;肠病毒感染与 DCM患者心脏功能降低有明显相关性。免疫转印法检测 VMC(n =34)和 DCM(n =2 6)患者血清抗 ADP/ ATP载体抗体 ,VMC组 2 3例 (67.6% )阳性 ,DCM组 1 2例 (46.2 % )阳性 ,而健康组均为阴性 ;抗 ADP/ ATP载体抗体和肠病毒 RNA的检出相关 (r=0 .442 )。结论 :肠病毒RNA和抗 ADP/ ATP载体抗体在病毒性心脏病患者中检出具有相关性 ,对临床上出现前驱感染和心脏症状的患者 ,及时进行肠病毒 RNA、CVB- Ig M、抗 ADP/ ATP载体抗体的检测 ,有助于 VMC和 DCM的早期诊断。     

结肠特异性基因RELMβ的克隆及其真核表达载体构建

目的:观察克隆小鼠结肠特异性基因RELMβ,并构建其真核表达载体.方法:采用Western blot、Northern blot方法检测RELMβ基因在小鼠不同脏器中的表达;从小鼠结肠组织中提取总RNA,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增RELMβ全长cDNA,克隆至T载体后进行核酸序列分析,并将其正向插入到真核表达载体pcDNA3.1/Zeo( )的限制性内切酶位点EcoR I:重组子在阳离子脂质体Lipofectamine 2000的介导下瞬时转染小鼠胚胎纤维母细胞NIH/3T3、结肠癌细胞系CT26,Western blot及RT-PCR法检测细胞RELMβ表达水平.结果:RELMβmRNA和蛋白特异表达于小鼠结肠,而其他脏器未见表达.成功克隆了小鼠RELMβ全长cDNA(318 bp),与已报道序列的同源性高达99%,获得GenBank登录号DQ157777.真核表达载体pcDNA3.1-RELMβ转染细胞后,细胞内RELMβmRNA和蛋白水平均显著增高(P<0.01).结论:从小鼠结肠组织中克隆出RELMβ特异性表达基因,为深入研究RELMβ基因的生物学作用及其在结肠疾病靶向治疗中的作用奠定了基础.     

DNA甲基转移酶3b催化区保守序列shRNA真核表达载体构建

目的构建针对基因DNA甲基转移酶3bmRNA催化区保守序列的shRNA真核表达载体,并对其克隆进行鉴定。方法以DNMT3bmRNA序列为靶基因设计3条shRNA和一条阴性对照HK,应用基因重组技术将其克隆到真核表达载体PGensil-1中,构建真核表达载体P-DNMT3b-shRNA1、P-DNMT3b-shRNA2、P-DNMT3b-shRNA3、P-HK。将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中,接种于LB平板后分别挑取5个单克隆菌落进行扩增,经筛选后对提取质粒进行测序鉴定。结果重组质粒经SalI酶切鉴定得到大小2个基因片段,大片段约为4．55kb,小片段约为440bp,与设计相同;四组重组质粒经测序鉴定显示插入完全正确。结论成功构建了P-DNMT3b-shRNA（1、2、3）及HK真核表达载体,为下一步实验奠定了基础。     

姜黄素前体药物的合成及其体外抗肿瘤活性研究

目的制备姜黄素前体药物,使其在肿瘤细胞内高选择性活化,为进一步开展肿瘤靶向性化疗奠定基础。方法以姜黄素分子结构为基础,化学合成N-马来酰-L-缬氨酸酯姜黄素、N-马来酰-甘氨酸酯姜黄素,红外光谱法进行鉴定;MTT比色分析法比较两种姜黄素前体药物作用6~24 h后,人膀胱癌EJ细胞及肾小管上皮HKC细胞生长抑制的差异。结果20~40μmol.L-1的N-马来酰-L-缬氨酸酯姜黄素、N-马来酰-甘氨酸酯姜黄素作用6~24 h后,EJ细胞生长抑制率分别为6.71%~65.13%(P<0.05)、10.96%~73.01%(P<0.05),呈浓度、时间依赖性。与同浓度姜黄素比较,两种前体药物对HKC细胞生长的抑制作用均降低(P<0.01)。结论本研究成功的合成了两种姜黄素的前体药物,N-马来酰-L-缬氨酸酯姜黄素、N-马来酰-甘氨酸酯姜黄素;二者均能体外抑制人膀胱癌EJ细胞增殖,其对人肾小管上皮HKC细胞的抑制毒性作用低于姜黄素。     

γ-干扰素对姜黄素抑制HL-60细胞增殖的影响

目的：为研究在姜黄素作用下,基因重组干扰素γ（rh-ＩＦＮ－γ）对白血病细胞杀伤能 力的影响。方法：选用ＨＬ－６０细胞系,采用细胞培养、ＳＡＢＣ法测定Ｂrdu摄取率? 流式细胞仪检测及末端ＴdＴ酶标技术。结果：发现姜黄素抑制细胞增殖作用随浓度增加而逐渐增加,在２５umol/：浓度体外处理ＨＬ－６０细胞２４小时后,增殖抑制率为４３． ７５％±２．００％,ＩＦＮ－γ使这种作用明显提高,增殖抑制率增至８０％。进一步分     

心脏M2-胆碱能受体抗体的检测

近年研究发现 ,慢性病毒性心肌炎 (VMC)、扩张型心肌病 (DCM)与持续性病毒感染和自身免疫抗体有关。Fu等[1]在DCM患者血清中发现抗M2 胆碱能受体抗体。本研究以与人心脏中M2 胆碱能受体胞外第二个环形结构 16 9～ 193位置氨基酸序列作模板 ,以人工合成多肽作抗原 ,建立酶联免疫吸附试验 (ELISA)方法检测血清中M2 受体抗体。一、对象和方法1.对象 :VMC患者 5 0例 ,男 30例 ,女 2 0例 ,年龄 12～ 6 0岁。DCM患者 5 0例 ,男 33例 ,女 17例 ,年龄 16～ 5 9岁。均符合 1995年全国心肌炎、心肌病专题研讨会诊断标准。健康献血员 4 0名…