腺病毒介导bcl-2基因转染对顺铂所致大鼠螺旋神经节细胞损伤的拮抗作用

目的 通过腺病毒(adenovirus,Ad)载体介导bcl-2基因转染体外培养的新生大鼠耳蜗螺旋神经节细胞(spiral ganglion cells,SGC),探讨bel-2蛋白过度表达对顺铂所致SGC损伤的拮抗作用.方法 体外培养新生大鼠SGC,携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)基因的腺病毒载体Ad-GFP转染SGC,并行神经丝蛋白(NF200)免疫细胞化学染色鉴定,激光共聚焦扫描荧光显微镜下观察.携带bel-2基因的腺病毒载体Ad-bel-2转染SGC,蛋白质印迹法(Western Blot)检测bcl-2蛋白表达.设立Ad-bcl-2转染加顺铂组(A组),Ad-GFP转染加顺铂组(B组),顺铂组(C组)和正常对照组(D组),顺铂作用浓度为2μg,/ml;顺铂作用48 h后,行各组SGC计数,并通过lmageJ软件测量各组SGC轴突长度.结果 成功分离并培养新生大鼠SGC.激光共聚焦扫描荧光显微镜下观察到腺病毒载体可安全高效转染体外培养的SGC.Ad-bcl-2转染3 d后,Western Blot检测有外源性人bcl-2基因的高效表达,而Ad-GFP转染组和顺铂组未检测到表达.顺铂作用后,A、B、C组部分SGC细胞突起变短、萎缩,胞体缩小、变圆,甚至浮起.A组SGC数目明显多于B组和C组(P值均＜0.01),但少于D组(P＜0.05);A组SGC轴突长度明显长于B组和C组,但短于D组(P值均＜0.01).结论 腺病毒能够安全高效地转染体外培养的新生大鼠SGC.bel-2蛋白过表达对顺铂所致SGC损伤有一定的拮抗作用.     

呼吸道合胞病毒G基因的扩增

用未纯化的呼吸道合胞病毒细胞混和物，采用改良胍－热酚法提取病毒ｍＲＮＡ，反转录合成ｃＤＮＡ，经ＰＣＲ扩增得到大小约９２０ｂｐ的产物。经ＰｓｔＩ酶切表明其中含有ＰｓｔＩ酶切应点，证实其产物确为ＲＳＶＧ基因。此法简便、特异、第三、快速、。由于ＲＳＶ极不稳定，ＲＮＡ甚易降解，此法值得推广应用。     

过继转输抗L3T4单抗治疗的心肌病小鼠脾细胞对心肌抗体的影响

目的 通过对心肌自身抗体的分析探讨Th细胞在自身免疫性心肌病发病机制中的作用.方法 用含有人线粒体ADP/ATP载体肽的免疫液多次免疫Balb/c小鼠得到心肌病组(n=6),单抗组(n=6)小鼠在给予ADP/ATP肽免疫的第0、1和2天,同时接受尾静脉注射400 μg抗L3T4单抗;第180天时,将单抗组小鼠的脾细胞取出转输到正常小鼠体内(转输组,n=6),此小鼠亦同时给予多肽免疫,方法同心肌病组.对照组(n=6),以不含多肽的盐水免疫小鼠,时间和剂量同心肌病组.以ELISA法检测各组小鼠血清抗ADP/ATP载体自身抗体水平及IgG亚型的变化;以实时荧光定量PCR法检测各组小鼠T细胞中的细胞因子mRNA的表达.结果 转输组小鼠血清自身抗体在各时间点均为阴性,类似于单抗组和对照组,而心肌病组抗体水平在各时间点均显著高于对照组(P<0.01);转输组IgG1亚型的生成受到明显抑制;细胞因子(IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-6)表达在单抗组和转输组均受到显著抑制.结论 Th细胞介导的免疫应答在自身免疫性心肌病的发病机制中起重要作用.     

Uroplakin Ⅱ基因在膀胱移行细胞癌中的表达及相关性研究

目的　探讨UroplakinⅡ基因 (UPⅡ )在原发和转移性膀胱移行细胞癌 (TCC)中表达与意义。方法　收集 45例膀胱癌 (其中TCC 3 9例 ,非TCC 6例 )患者的癌组织 ,外周静脉血标本 ,提取总RNA ,行逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR ) ,检测UPⅡ基因mRNA的表达。 2 5例其他部位肿瘤及 8例非肿瘤患者组织标本和静脉血作为对照。结果　 45例膀胱肿瘤组织标本中 ,UPⅡ基因在TCC组织中平均阳性率 82 .1% (3 2 /3 9) ,6例非TCC类型膀胱癌 0表达。在T1、T2、T3、T4期膀胱TCC患者组织中UPⅡ基因阳性率分别为 76.5 %、71.4%、90 .9%、10 0 .0 % ;在患者外周血中UPⅡ基因阳性率分别为 5 .9%、14 .2 %、72 .7%、10 0 .0 %。在组织和外周血中低分期 (T1、T2 )与高分期 (T3、T4)TCC表达UPⅡ基因阳性率差异有显著性 (P <0 .0 5 )。其中 4例转移者均阳性 ,接受全身化疗后 3例未再表达。 2 5例其他部位肿瘤组织标本 ,7例肺癌在组织中有 1例阳性表达 ,外周静脉血中 0表达 ;5例肾移行细胞癌在组织中 2例阳性 ,外周静脉血 0表达 ;8例非肿瘤患者组织标本及外周静脉中 0表达。结论　组织及外周血中UPⅡ表达阳性率与肿瘤分期 ,是否转移呈相关性 ;检测TCC患者血中UPⅡ基因可作为监测TCC患者是否转移的指标 ,并可在一定程度上反映化疗疗效 ;     

shRNA沉默基因DNMT1的表达对膀胱癌T24细胞增殖与凋亡的影响

目的 体外研究shRNA(short hairpin RNA)沉默基因DNMTl的表达对膀胱癌T24细胞增殖和凋亡的影响,初步探讨DNMT1在膀胱肿瘤形成过程中的作用机制.方法 实验分为空白对照组(给予脂质体)、HK组(含无效干扰序列的质粒)及pshRNA-DNMT1组;常规培养膀胱癌T24细胞株,用脂质体Lipofeetamine 2000将构建成功的重组质粒pshRNA-DNMT1转染进入T24细胞,然后进行RT-PCR、Western blot检测各组DNMT1 mRNA及蛋白质水平变化;进行MTT,Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术检测各组T24细胞增殖和凋亡情况.结果 重组质粒pshR-NA-DNMT1成功转染进入膀胱癌T24细胞;经RT-PCR检测pshRNA-DNMT1组DNMT1 mRNA表达减少,24、48、72h的抑制率分别是28.44%、52.48%、70.91%;转染pshRNA-DNMT1后,T24细胞中DNMT1蛋白24、48和72 h的抑制率分别为24.27%、57.79%、69.74%;在MTT检测中,pshRNA-DNMT1组的细胞增殖抑制率在24、48、72 h分别为(4.34±0.76)%,(9.87±1.54)%和(13.78±1.93)%,与空白对照组比较各时间点差异均有极显著性意义(均P<0.01);转染24、48和72 h后,pshRNA-DNMT1组细胞凋亡率分别为(3.87±0.81)%、(8.69±1.23)%和(11.46±1.24)%,与空白对照组比较差异均有极显著性意义(均P<0.01).结论 重组质粒pshRNA-DNMT1能有效降低膀胱癌细胞中DNMT1基因mRNA及蛋白的表达,并在一定程度上抑制T24细胞的增殖和促进凋亡.     

细胞打印的可行性研究

目的:探讨初步建立一个细胞打印系统,进行细胞无损伤打印的可行性。方法:常规培养人类宫颈癌细胞株Hela细胞,收获后做成细胞悬液代替喷墨封装入墨盒,改装喷墨打印机进行细胞打印,检测打印后细胞的活性,并与未经打印组细胞对照。结果:经过喷墨打印后细胞能够快速、精确的定位于目标区域,并且能够维持正常细胞形态、保持生物活力并继续生长、分裂增值。结论:细胞无损伤打印是可行的,为进一步的器官打印研究提供依据、探索方法。     

现场检测中标本的抗凝和运送

现场检测（POCT）也称床边检测或就地检测,指在患者旁边进行的临床检测。通常不一定由临床检验师来操作,POCT的主要特点是不需要固定的检测场所,试剂和仪器是便携式的,并且可及时操作。由于能快速、简便和及时地检测患者的临床指标,缩短了患者治疗转换周期,有效地消除了一些试验的影响因素,其应用前景越来越广。POCT使用最多的是血液标本,其中一些检测对标本抗凝和运送有着严格的要求。下面就一些常见检测项目的血液标本抗凝和运送加以阐述。     

膀胱癌干细胞关键转录因子Oct4的表达及与肿瘤干细胞的关系

目的检测干细胞关键转录因子Oct4在人膀胱癌组织及细胞系BIU-87中的表达，探讨Oct4的表达在膀胱癌发生发展中的意义及与肿瘤干细胞的关系。方法采用免疫组织化学方法对49例膀胱癌组织病理标本、采用免疫细胞荧光和逆转录-聚合酶链反应（RT—PCR）方法对膀胱癌细胞系BIU-87进行Oct4表达的检测。结果Oct4在膀胱癌中的表达率为81．6％（40／49），Oct4阳性细胞率约为0．6％，Oct4表达的阳性细胞率及强度与膀胱癌的分级、复发和转移无明显相关性（P〉0．05）。在BIU-87细胞中存在少量的Oct4阳性细胞，RT-PCR证实存在Oct4的弱表达。结论膀胱癌中有少量细胞表达全能干细胞标志物Oct4，这些细胞很可能是膀胱癌干细胞，这将为其最终分离和鉴定人膀胱癌干细胞提供重要的基础。     

淋巴细胞转输对线粒体腺苷酸转位酶诱导的自身免疫性心肌病小鼠细胞因子的抑制作用

目的:研究淋巴细胞转输对线粒体腺苷酸转位酶(ANT)合成肽诱导的自身免疫性心肌病传染性耐受的小鼠Th1/Th2亚群及血清和心肌组织细胞因子的影响。方法:用ANT多肽多次免疫Balb/C小鼠得到心肌病组,单抗组小鼠在给予ADP/ATP肽免疫的第0、1和2天,同时接受尾静脉注射400μg抗L3T4单抗;第6个月末时,将单抗组小鼠的脾细胞取出转输到正常小鼠体内(转输组),此小鼠亦同时给予多肽免疫,方法同心肌病组。对照组以不含ANT的相同免疫进行假性免疫,时间和剂量同心肌病组。采用流式细胞术检测脾T细胞内细胞因子IFN-γ/IL-4的含量;以ELISA法检测其血清中IFN-γ、白细胞介素-2(IL-2)、IL-4、IL-6和肿瘤坏死因子(TNF-α)水平;实时荧光定量PCR法检测其心肌细胞因子mRNA表达。结果:转输组Th细胞IFN-γ、IL-4含量与对照组和单抗组接近且明显低于心肌病组;转输组小鼠血清IFN-γ和IL-2水平明显高于心肌病组而低于单抗组,IL-4和IL-6水平显著低于心肌病组;TNF-α水平在转输组则最高;心肌细胞因子mRNA的表达则转输组显著低于心肌病组,与对照组和单抗组相近。结论:淋巴细胞转输能够阻断心肌病诱导过程中绝大部分细胞因子的生成,与单抗早期干预的结果类似。     

抗L3T4单抗早期干预对心肌病小鼠细胞因子的影响

目的研究早期应用抗L3T4单抗对心肌病小鼠血清和心肌组织中细胞因子的影响，探讨抗L3T4单抗治疗自身免疫性心肌病的机制。方法用含有人线粒体ADP／ATP载体肽的免疫液免疫近交系Balb／C小鼠建立类扩张型心肌病模型（心肌病组）；以不合肽免疫液免疫小鼠作为对照组；在同时用含有ADP／ATP载体肽的免疫液免疫小鼠的前1d连续3d以400μg抗L3T4单抗免疫小鼠获得单抗组。采用流式细胞术检测小鼠脾脏中CD44T细胞内IFN-γ／IL-4的表达；以ELISA法检测其血清中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-6和TNF-α水平；实时荧光定量PCR法检测其心肌细胞因子基因表达。结果心肌病组小鼠血清IFN-γ和IL-4水平明显高于对照组，而单抗早期干预使其生成受到抑制，此结果与流式细胞仪检测到的T细胞内IFN-γ和IL-4水平相-致；血清中IL-2含量在3组小鼠差异均无显著性；TNF-α则在单抗组显著高于对照组和心肌病组。从心肌组织中细胞因子表达情况来看，心肌病组各种细胞因子合成均增多，而早期应用单抗能够抑制其基因表达。结论抗L3T4单抗能够阻断绝大部分细胞因子的生成，从而能够治疗实验鼠自身免疫性心肌病。