姜黄素前体药物的合成及其体外抗肿瘤活性研究

目的制备姜黄素前体药物,使其在肿瘤细胞内高选择性活化,为进一步开展肿瘤靶向性化疗奠定基础。方法以姜黄素分子结构为基础,化学合成N-马来酰-L-缬氨酸酯姜黄素、N-马来酰-甘氨酸酯姜黄素,红外光谱法进行鉴定;MTT比色分析法比较两种姜黄素前体药物作用6~24 h后,人膀胱癌EJ细胞及肾小管上皮HKC细胞生长抑制的差异。结果20~40μmol.L-1的N-马来酰-L-缬氨酸酯姜黄素、N-马来酰-甘氨酸酯姜黄素作用6~24 h后,EJ细胞生长抑制率分别为6.71%~65.13%(P<0.05)、10.96%~73.01%(P<0.05),呈浓度、时间依赖性。与同浓度姜黄素比较,两种前体药物对HKC细胞生长的抑制作用均降低(P<0.01)。结论本研究成功的合成了两种姜黄素的前体药物,N-马来酰-L-缬氨酸酯姜黄素、N-马来酰-甘氨酸酯姜黄素;二者均能体外抑制人膀胱癌EJ细胞增殖,其对人肾小管上皮HKC细胞的抑制毒性作用低于姜黄素。     

DNA甲基转移酶3b催化区保守序列shRNA真核表达载体构建

目的构建针对基因DNA甲基转移酶3bmRNA催化区保守序列的shRNA真核表达载体,并对其克隆进行鉴定。方法以DNMT3bmRNA序列为靶基因设计3条shRNA和一条阴性对照HK,应用基因重组技术将其克隆到真核表达载体PGensil-1中,构建真核表达载体P-DNMT3b-shRNA1、P-DNMT3b-shRNA2、P-DNMT3b-shRNA3、P-HK。将重组质粒转化到大肠杆菌DH5α中,接种于LB平板后分别挑取5个单克隆菌落进行扩增,经筛选后对提取质粒进行测序鉴定。结果重组质粒经SalI酶切鉴定得到大小2个基因片段,大片段约为4．55kb,小片段约为440bp,与设计相同;四组重组质粒经测序鉴定显示插入完全正确。结论成功构建了P-DNMT3b-shRNA（1、2、3）及HK真核表达载体,为下一步实验奠定了基础。     

TRAF6shRNA对LPS/TLR4信号传导通路的体外干预作用

目的:体外研究shRNA(short hairpin RNA)沉默基因TRAF6的表达对RAW264.7细胞增殖的影响,初步探讨TRAF6-shRNA对LPS/TLR4胞内信号转导的影响.方法:构建靶向抑制小鼠TRAF6的shRNA的真核表达载体,转染RAW264.7细胞后培养48h,予以终浓度为100 ng/mL的L...     

大黄素对急性淤胆型肝炎模型大鼠的治疗作用及机制

目的 初步探讨大黄素对急性淤胆型肝炎模型大鼠的治疗作用及机制.方法 SD大鼠分为5组:大黄素组、熊去氧胆酸组、地塞米松组、模型组、正常对照组,各24只.除正常对照组外,其余4组均给予α-异硫氰酸萘酯(ANJT)50 mg/kg一次灌胃大鼠建立淤胆型肝炎动物模型,并给予相应的药物干预.造模后24、48、72 h 3个时间点采集标本(每时间点8只),检测肝功能和肝脏病理学检查.实时荧光定最PCR检测肝组织中细胞因子诱导的中性粒细胞趋化因子1(CINC-1)、巨噬细胞炎症蛋白2(MIP-2)mRNA表达,Western印迹法检测肝组织中细胞间黏附分子1(ICAM-1)蛋白表达.结果 大黄素组24、48、72 h各时间点总胆红素[TB,(32.8±3.7)μmol/L、(61.0±16.4)μmol/L、(10.8±4.5)μmol/L],直接胆红素[DB,(26.03±3.10)μmol/L、(49.40±18.16)μmol/L、(8.04±3.03)μmol/L],丙氨酸氨基转移酶[ALT,(314±50)U/L、(664±97)U/L、(200±60)U/L]均明显低于模型组(均P<0.05),天冬氨酸氨基转移酶(AST)48、72 h时间点、碱性磷酸酶(ALP)48 h、γ-谷氨酰转移酶(GGT)72 h、总胆汁酸(TBA)48、72 h时间点均明显低于同时间点模型组(均P<0.05);TB24、48 h,DB、ALT 24 h,TBA 24 h[(204±55)μmol/L]、72 h,均明显低于同时间点熊去氧胆酸组(均P<0.05);TB、TBA 24、48 h,AIX、AST、GGT各时间点,时间点均明显低于同时间点地塞米松组(均P<0.05).各时间点大黄素组的CINC-1、MIP-2 mRNA表达和ICAM-1蛋白表达水平均明显低于同时间点模型组(均P<0.05).结论 大黄素治疗ANIT诱导的急性淤胆型肝炎模型大鼠的作用以降低TB、DB、ALT最为显著,起效比熊去氧胆酸快,其对ALT、AST、GGT、TBA的作用优于地塞米松.其作用机制可能与抑制CINC-1、M1P-2、ICAM-1的活化有关.     

参芪扶正液对肺腺癌细胞GLC-82X射线照射后TGF-β1表达调控的研究

目的 阐明参芪扶正液对肺腺癌细胞株GLC-82 X射线照射后TGF-β₁表达的调控,探讨中药防治放射性肺损伤的分子机制。方法选取人低分化肺腺癌细胞株GLC-82,加入终浓度为1.563 mg/ml参芪扶正液后随机分组:1照射剂量关系组:分别予0、20、30和40 Gy剂量的X射线照射,于照射后6 h提取细胞总RNA。 2时间关系组:接受20 Gy的X射线照射,分别在照射后12、24和48 h提取细胞总RNA。2组均采用RT-PCR法检测TGF-β₁mRNA表达。结果剂量关系组:GLC-82细胞接受X射线照射后TGF-β₁mRNA表达量明显增高,在20 Gy照射后达到高峰,为基础未照射水平细胞的5倍。参芪扶正干预组与单纯照射组相比,其TGF-β ₁mRNA相对表达量均有不同程度下调,在吸收剂量达20 Gy时差异有统计学意义(P＜0.05)。时间关系组:GLC-82细胞经20 Gy X射线照射后在不同时间点参芪扶正干预组与单纯照射组相比,其TGF-β₁ mRNA相对表达量均有不同程度下调,受照后48 h 差异有统计学意义(P＜0.01)。结论TGF-β₁在放射性肺损伤发生、发展过程中起着重要作用,而参芪扶正液能明显降低该过程中TGF-β₁表达水平,提示参芪扶正液可能通过调控该细胞因子来起到辐射防护之作用。     

肌球蛋白致自身免疫性心肌疾病的实验研揪

目的探索在没有病毒感染的情况下,自身免疫机制在心肌炎和心肌病发病中的作用.方法 (1) 猪心肌肌球蛋白致BALB/C鼠自身免疫性心肌疾病模型的复制实验组(n=32)于实验的第0,7和30天3次注射肌球蛋白,对照组(n=20)与实验组同样的时间注射弗氏完全佐剂,于初次免疫后的第15,21和120天分别留取血清和心肌标本.(2)病毒性心肌炎模型的复制病毒接种组(n=22)给予103 TCID50/0.1 ml CVB3溶液腹腔注射,对照组(n=10)给予Vero细胞冻融液0.1 ml腹腔注射,接种时间及采样时间同肌球蛋白免疫组.(3)抗体检测ELISA法检测小鼠血清抗肌球蛋白抗体.结果病理结果显示,肌球蛋白致心肌炎小鼠急性期(15和21 d)以心肌纤维变性坏死和淋巴细胞浸润较明显,间质病变较轻,内膜和心瓣膜无明显改变;慢性期(120d)仅见心肌纤维化, 急慢性期均可检测到高滴度的抗肌球蛋白抗体(P<0.001),对照组为正常心肌,抗体滴度低.病毒接种组慢性期亦显示成纤维细胞增生.结论心肌肌球蛋白可以作为自身抗原刺激机体产生自身免疫反应,在没有病毒感染的情况下,单一的自身免疫机制即可导致心肌炎向心肌病的转化.     

儿童抽动-秽语综合征HCMV pp65抗原检测的临床意义

目的探讨儿童巨细胞病毒(Hum an cytom egalov irus,HCMV)活动性感染与抽动-秽语综合征(T ourette’s sym-drom e,TS)的关系。方法离心分离64例抽动-秽语综合征患儿和40例正常儿童外周血单个核细胞(PBM C s)和血浆,分别用免疫荧光法和定量PCR检测HCMV pp65抗原和HCMV DNA,并比较2种方法的一致性。结果64例TS患儿HCMV pp65抗原有14例阳性,阳性率21.9%,40例正常儿童HCMV pp65抗原有1例阳性,阳性率2.5%,2组儿童HCMV感染率有显著性差异(2χ=7.49,P<0.01)。免疫荧光法和实时定量PCR有较好的一致性(89.1%)。结论抽动-秽语综合征儿童HCMV感染率显著高于正常儿童,HCMV活动性感染可能诱发抽动-秽语综合征。     

用抗人IgM(μ链)单克隆抗体诊断血吸虫病的研究

本文报告用抗人IgM(μ链)单克隆抗体ELISA法诊断血吸虫病。检测急性血吸虫病150例、慢性血吸虫病208例、经吡喹酮治疗后6个月粪检转阴的慢性血吸虫病28例、肝吸虫32例,阳性检出率分别为100.00％、88.46％、3.57％、15.63％;检测健康人50例均为阴性。动物实验早期诊断,观察3只感染血吸虫病猴,检测IgM(μ链)抗体,第28d均呈现阳性,比IgG-ELISA 42d、COPT 41d、粪检45d呈现阳性时间早。表明抗人IgM(μ链)单克隆抗体用于诊断血吸虫病,具有高度敏感性和特异性及疗效考核价值。     

慢性乙型肝炎患者干扰素应答与外周血单核细胞IFN-α和IL-18表达的关系

目的分析慢性乙型肝炎(CHB)患者外周血单核细胞(PBMC)干扰素-α(IFN-α)及白细胞介素18(IL-18)mRNA的诱导表达差异,评价慢性乙型肝炎患者PBMC细胞免疫功能。方法对2004年6月至2005年5月华中科技大学同济医学院附属协和医院52例门诊和住院CHB患者,聚肌胞苷酸(PolyIC)体外刺激正常对照组和CHB组患者PBMC,取培养上清利用病毒保护试验测定IFN-α2b治疗前后PBMC表达的干扰素抗病毒生物学活性。同时用脂多糖(LPS)体外刺激不同组PBMC,RT-PCR检测PBMCIL-18mR-NA水平的变化。结果治疗前干扰素治疗应答组(n=13)和无应答组(n=27)PBMC分泌的干扰素生物学活性均显著低于对照组(n=20)(均P<0.01)。应答组干扰素活性随治疗时间延长而增加,1个月时已显著高于无应答组(P<0.01);无应答组干扰素活性始终处于低下水平。治疗前,应答组和无应答组PBMCIL-18mRNA水平也显著低于对照组(均P<0.01);治疗后,应答组IL-18mRNA水平随治疗时间延长而升高,1个月时也著显高于无应答组(P<0.01),无应答组IL-18mRNA水平始终较低。PBMCIFN-α活性和IL-18mRNA水平有良好的正相关性(r=0.922,P<0.01)。结论慢性HBV感染患者的细胞免疫功能受损,不能正常表达IFN-α和IL-18,但应答组患者经干扰素治疗后表达能力逐渐恢复。