用BA-ELISA法测定载脂蛋白A-I

介绍一种高灵敏度的裁脂蛋白A-I(Apo A-I)的测定方法——生物素-亲和素酶联免疫吸附测定法(BA-ELISA)。本法的工作范围为0.25～4ng Apo A-I,灵敏度约0.1ngAp0 A-I,较已报道的放射免疫法(RIA)和ELISA高3～5倍以上。热处理或加入变性剂均不影响人血清Apo A-I的免疫测定结果。组内和组间变异系数分别为4.55和8.04。经本法测定77名正常成年人血清Apo A-I为1.34±0.23g/L((?)±SD),而且正常成年人血清ApoA-I浓度与高密度脂蛋白-胆固醇(HDL-C)的浓度呈高度相关(r=0.83,p<0.001)。     

临床实验室质量管理体系文件的控制实践

文件控制是质量管理体系的重要组成部分,如何对实验室质量管理体系文件实施控制并防止意外使用废止文件,是实验室的质量管理体系运行必须高度关注的问题。本文介绍了实验室文件的分类、管理流程和文件控制的一些具体措施,并就文件控制中出现的一些问题和改进措施进行了探讨。     

熔解曲线分析检测临床常见4种革兰阳性菌的方法建立

目的 构建熔解曲线分析法同时检测4种临床常见革兰阳性病原菌,为临床感染性疾病的诊疗提供快速、敏感的分子生物学检测信息.方法 选取临床最常见的革兰阳性病原菌:金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌做为本课题研究的检测菌种.根据检测菌种的不同,分别选取不同菌种的特异性靶序列,设计种特异性引物.对种特异性引物分别用标准菌株、临床分离目标菌株、临床分离非目标菌株、非细菌性病原体以及人源基因组DNA进行常规PCR扩增以及扩增产物测序,验证引物的特异性.对目标菌种引物进行荧光PCR预实验,筛选Tm值差异较大的多对引物,进行熔解曲线分析法实验,并对熔解曲线法的反应条件与反应体系进行优化.对优化后的熔解曲线法进行特异性验证.通过检测加入人血液中的不同细菌浓度对该方法进行敏感性分析.应用所构建的方法分别检测临床分离目标菌种各20株,分析每种菌种的熔解曲线图,熔点温度(Tm值)及其标准差(SD)的变化,评价所构建方法的稳定性.结果 ①对所设计的种特异性引物经常规PCR扩增产物电泳分析显示,目标菌株均有目的特异性扩增产物,非目标菌株、非细菌性病原体以及人源基因组DNA未出现特异性电泳条带.特异性扩增产物测序所得序列比对分析显示与目的菌种序列相符.②对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌的4对引物同时进行熔解曲线分析和mecA基因熔解曲线分析的条件优化结果:预变性温度94℃、120s,变性温度94℃、20s:退火温度53℃、12s;延伸温度68℃、13s;扩增循环数为40个循环,熔解曲线分析温度75℃～95℃.最佳的引物浓度为300nmol/L.③所建立的方法经特异性分析显示,上述4种目标菌种均有特异性熔解曲线,Tm值依次为81.02℃;80.32℃;82.37℃:83.10℃,峰高(cm)/峰宽(cm)均大于2.6,以此为典型的熔解曲线判断标准,则非目标菌、非细菌性病原体以及人源基因组DNA分析未见典型的熔解曲线.④方法的敏感性分析显示,上述4种目标菌和mecA基因可检测到的血液细菌浓度依次为:550、520、470、500与203CFU/mL.⑤对上述4菌和MRSA的临床分离菌各20株进行检测,结果显示,其平均Tm值依次为(80.96±0.688)℃,(80.20±0.729)℃,(82.42±0.599)℃,(83.20±0.713)℃和(80.11±0.15)℃.结论 本研究所设计的针对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌和mecA基因检测引物具有较好的菌种特异性,可用于相应病原菌熔解曲线分析法的建立;所构建的熔解曲线法具有较好的特异性、敏感性和稳定性;并具有快速、简便、成本低廉的特点,可用于临床样本的检测;但葡萄球菌属内和肠球菌属内的Tm值较接近,必要时,可进一步用单对引物检测分析以鉴定到种.     

产ESBLs大肠埃希菌的耐药性分析 FREE

目的了解昆明市第一人民医院产超广谱β 内酰胺酶（ESBLs）大肠埃希菌的检出及耐药情况。方法对该院2006年1-12月临床分离的293株大肠埃希菌,用表型确证试验检测ESBLs,K B琼脂纸片扩散法做药物敏感试验。结果293株大肠埃希菌中,检出产ESBLs菌168株（57.34%）。各类标本中,产ESBLs率以痰标本分离株（64.71%）最高,其次为血液（62.50%）和脓液标本（57.14%）;各科室中,产ESBLs率以重症监护室（ICU）分离株（65.22%）最高,其次为内分泌科（65.00%）和肿瘤科（63.33%）。除亚胺培南和阿米卡星外,产ESBLs菌对其他14种常用抗菌药物的耐药率均明显高于非产ESBLs菌(均P<0.01);产ESBLs菌株不仅对青霉素、头孢菌素、氨曲南等抗生素广泛耐药,同时对喹诺酮类、氨基糖苷类、磺胺类等多种抗菌药物耐药,仅对亚胺培南、阿米卡星的耐药率＜5%(分别为0.00%、3.30%)。结论昆明市第一人民医院临床分离大肠埃希菌产ESBLs率较高;产ESBLs菌株对临床常用多种抗菌药物严重耐药,可经验选用的药物十分有限。临床医生应根据病原菌药敏结果合理选用抗菌药物,以提高治疗效果。     

纸片扩散法检测临床分离深部真菌对氟康唑的敏感性

目的探讨294株临床分离酵母样真菌对氟康唑的体外敏感性,以指导临床用药。方法收集自2004年1月至2007年5月从我院住院患者送检的标本,应用美国临床实验室标准研究院（CLSI）认可的酵母菌纸片扩散法进行敏感实验。结果294株酵母样真菌菌种分布显示,白色念珠菌常见,有214株,占72.8%;光滑念珠菌34株,占11.6%;热带念珠菌32株,占10.9%;克柔念珠菌4株,占1.4%;其它念珠菌属10株,占3.4%;白色念珠菌,光滑念珠菌,热带念珠菌,克柔念珠菌,及其它念珠菌属对氟康唑的耐药率存在差异,耐药率分别为4.2%、17.6%、0.0%、50.0%、33.3%,并呈逐年升高趋势。     

2008年中国15所教学医院医院感染患者分离的肠杆菌科细菌耐药性分析

目的监测2008年我国不同地区15所教学医院医院感染患者中分离的肠杆菌科细菌的耐药性。方法按设计方案收集非重复的1 357株医院感染患者中分离的肠杆菌科细菌。菌株经中心实验室复核后,采用琼脂稀释法测定15种抗菌药物的最低抑菌浓度(MIC),数据输入WHONET5.6软件进行统计分析。结果大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和奇异变形杆菌敏感率较高的药物有美罗培南(97.6%～100%)、帕尼培南(79.8%～98.4%)、亚胺培南(64.9%～98.1%)、厄他培南(91.3%～97.4%)、哌拉西林-他唑巴坦(87.2%～97.4%)、头孢美唑(82.1%～97.0%)和阿米卡星(89.9%～93.8%)。肠杆菌属细菌敏感率较高的抗菌药物有美罗培南(98.7%)、帕尼培南(96.4%)、亚胺培南(95.4%)和阿米卡星(85.7%)。弗劳地枸橼酸杆菌和黏质沙雷菌敏感率较高的药物有碳青霉烯类抗生素(92.0%～100%)、哌拉西林-他唑巴坦(93.1%～99.1%)、阿米卡星(89.0%～94.3%)和头孢吡肟(86.2%～93.1%)。结论碳青霉烯类抗生素、哌拉西林-他唑巴坦和阿米卡星对医院分离的肠杆菌科细菌保持了较高的抗菌活性,头孢美唑对大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和奇异变形杆菌表现出良好的抗菌活性。     

高脂血症患者APOB／CIII／E基因多态性交互作用的研究

目的探讨原发性高脂血症载脂蛋白（Apo）B、CIII、E基因中ApoB MspI、ApoB XbaI、ApoB EcorI、ApoCIII3175、ApoCIII3206、ApoE112／158等7个位点基因多态性间的交互作用。方法采用病例一对照相关性研究策略,选择昆明地区汉族作为研究对象,用基因芯片检测技术,对91例高脂血症患者及76例健康对照者进行ApoB MspI、ApoB Xbal、ApoB EcorI、ApoCIII3175、ApoCIII3206、ApoE112／158等6个位点基因多态性进行检测。用比值比（odd ratio,OR）估计相对危险度。用MDR分析多基因相互作用。结果用MDR分析法,对昆明地区汉族高脂血症患者上述6个位点基因型多态性的基因-基因交互作用进行了分析,发现两位点MspI—E112／158、三位点MspI—CIIB206-E112／158和四位点MspI—XbaI—CIII3206-E112／158这三种模型均具有统计学意义（P〈0．001）,但三位点MspI—CIII3206-E112／15模型的交叉验证一致性系数最大（10／10）为最佳模型,该模型包含了位点ApoBMspI、ApoCIII3206和ApoE112／158位点．提示这三个基因位点之间可能存在基因-基因交互作用。该模型的Odd Ratio为14．870（95％CI：1．305—169．43）。结论发现昆明地区汉族人群7个高脂血症候选基因位点中,MspI—CIII3206-E112／158三个基因多态性之间可能存在基因-基因交互作用。     

熔解曲线分析检测临床常见3种革兰阴性菌的方法建立

目的 构建熔解曲线分析法同时检测临床常见3种革兰阴性病原菌.方法 选取临床常见的铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯杆菌、鲍曼不动杆菌作为本课题研究的检测菌种.对目标菌种设计种特异性引物.构建熔解曲线法,并进行特异性验证.检测不同拷贝浓度稀释液进行敏感性分析.检测临床分离目标菌各20株,进行稳定性评价.结果 (1)特异性验证结果显示,目标菌种均有特异性熔解曲线,Tm值依次为88.37℃; 86.32℃; 80.86℃; (2)敏感性分析结果显示,3种目标菌可检测到的拷贝浓度稀释液依次为:1.34×103拷贝/ml,3.67×103拷贝/ml,3.01×103拷贝/ml; (3)稳定性评价的结果显示,3种目标菌其平均Tm值依次为88.54±0.662; 86.38±0.727;80.12±0.607.结论 所构建的熔解曲线法具有较好的特异性、敏感性和稳定性;并具有快速、简便、成本低廉的特点,可用于临床样本的检测.     

BA—ELISA检测人血浆异常凝血酶原用于原发性肝癌的诊断

以钡盐吸附除去血浆凝血酶原后,用生物素—亲和素酶联免疫吸附测定法(Biotin Avidjn ELISA)检测了39例健康人,42例原发性肝细胞肝癌(HCC)患者及17例肝脏良性病变患者血浆异常凝血酶原(AP)含量,结果显示HCC患者血浆AP含量≥150ng/ml的占64.3％。20例血清甲胎蛋白(AFP)阴性患者血浆的60％AP含量≥150ng/ml。两者相结合,可使HCC诊断率提高到81％。对12例癌肿直径小于5 cmHCC患者的血浆AP含量的检测,得到类似的结果。提示血浆AP的检测,有助于提高HCC的诊断率。     

冠心病患者血清胆红素测定及临床意义初探

用重氮法检测了１０５例不同性别老年冠心病住院患者血清胆红素浓度，结果显示：冠心病患者血清总胆总体水平显著低于健康对照组，其均值仅为对照组的８２％，且在性别间无显著性差异。提示胆红素与冠心病之间存在负性相关关系。推测：血清正常浓度的胆红素可能通过阻止ＬＤＬ的氧化修饰，具有抗ＡＳ形成的作用，血清胆红素的降低可能为冠心病的又一危险信号。