一种高效的葡萄球菌基因敲除方法的建立与应用

目的 建立一种高效构建葡萄球菌基因敲除突变株的方法。方法 通过融合PCR将vraSR操纵子上、下游同源片段连接起来;通过基于位点特异性重组的Gateway克隆技术将融合PCR产物连接入温度敏感型穿梭质粒pKOR1,转化修饰缺陷型大肠杆菌DC10B,获得同源重组质粒pKOR1-vraSR;电转化表皮葡萄球菌RP62A株;在高温和氯霉素双重选择压力下,质粒通过第1次同源重组整合到表皮葡萄球菌染色体上;转移到无抗生素的培养基中继续培养,发生第2次同源重组;将菌液涂布于含1 μg/mL脱水四环素的培养基上进行反向筛选,那些未发生重组的整合菌株因表达必需基因secY的反义RNA而无法生存,最后,挑取菌落通过PCR进行鉴定。结果 成功构建了难以转化的表皮葡萄球菌RP62A株的vraSR基因敲除突变株。结论 利用大肠杆菌DC10B和穿梭质粒pKOR1对葡萄球菌进行基因敲除的方法简便高效,适用的范围更广泛。     

汉坦病毒核蛋白核心区域高效表达及产物鉴定

汉坦病毒是引起肾综合征出血热（HFRS）的主要病毒,汉坦病毒的基因由L、M、S三个片段构成,分别编码病毒RNA聚合酶,囊膜核蛋白G1和G2及核衣壳蛋白（简称核蛋白,Nucleocapsid Protein,NP）。血清学研究表明,汉坦病毒核蛋白具有很强的抗原性和免疫原性,同时NP抗原可以与汉坦病毒内的多种血清型病毒的免疫血清产生交叉反应,表明汉坦病毒的NP具有共同的抗原决定族。有鉴于此,我们对核蛋白的核心区域进行表达和纯化,并用SDS-PAGE和Western-Blotting对重组核蛋白进行鉴定,为其应用于诊断抗原提供技术依据。[第一段]     

肾综合征出血热患者血清样本中汉坦病毒RNA检测及其临床意义

目的 观察病毒血症在病程各期的变化。方法 根据汉坦病毒血清Ⅰ型７６－１１８株及血清Ⅱ型８０－３９株Ｍ基因Ｇ１区设计两对公有引物及一条探针,应用ＲＴ－ｎｅｓｔｅｄＰＣＲ方法对５７例９６份肾综合征出血热（ＨＦＲＳ）患者血清中ＨＶ－ＲＮＡ检测,所有ＰＣＲ产物用ＤＯＴ－Ｂｌｏｔ证实。结果 ９６份样本中６８份阳性,阳性率７８．８％;在病程第１、２、３周,ＨＶ－ＲＮＡ检测率分别为９４．７％、４７．５％、２５％     

β-lactamase genotyping of multi-drug resistant Acinetobacter baumannii in a neonatal intensive care unit

Objective To investigate the correlation between drug resistance and β-actamase genes of multi-drug resistance Acinetobacter baumannii (MDR-AB) in neonatal intensive care unit to provide evidence for rational antibiotics administration and nosocomial infection control.Methods Twenty-six MDR-AB strains were separated and collected from clinical specimens.The minimum inhibitory concentrations of 13 antimicrobial agents were determined by agar dilution method.Genotypes of β-lactamase were detected by polymerase chain reaction.Results The resistant rates of the 26 strains to Ceftazidime,Cefoxitin,Piperacillin-tazobactam and Ciprofloxacin were 100.0%.About 80.8% to 96.2% of these strains were resistant to the other antimicrobial drugs.Among the 26 MDR-AB strains,100% (26/26) strains possessed oxa-51,77% (20/26) possessed oxa-23 gene,54% (14/26) carried arnpC gene,both oxa-23 and ampC were identified in 42% (11/26) strains,while oxa-24,oxa-58,imp-1,imp-4 and vim-2 gene were not identified.Conclusions The drug resistance of Acinetobacter baumannii is serious,oxa-23 and ampC are the major plactamase genes carried by MDR-AB in neonatal intensive care unit.     

Lack of Association between fbe Gene with Adherence and Biofilm Formation in Staphylococcus epidermidis Clinical Isolates

Staphylococcus aureus (S. aureus) and Staphylococcusepidermidis (S.epidermidis) are clinically important spe cies in the Staphylococcus genus. S.aureus causes symp toms comprising cutaneous and invasive infections, toxicshock syndrome, septicemia and …     

Comparison and Evaluation of Three Animal Models for Studyingthe Pathogenicity of Staphylococcus epidermidis

Staphylococcus epidermidis was once thought as the normalflora of human skin that rarely causes disease in healthypersons, and isolation of this bacteria from clinical speci mens was generally taken as contamination. In recentyears, however, largely because of the increased use ofintra vascular catheters and other indwelling prosthetic de vices, S. epidermidis has emerged as a major nosocomialpathogen in biomaterial associated infections [1,2]. It hasbeen suggested that S. epidermid…     

利用动物模型评估亚甲蓝光化学法红细胞病毒灭活效果

目的　评估亚甲蓝光化学法 (MB P) (亚甲蓝浓度 5 μmol/L ,光照时间 1h ,光照强度 380 0 0lux)红细胞病毒灭活的安全性、有效性。方法　①建立Beagle犬急性失血性贫血模型 ,观察经MB P处理的Beagle犬自体纠正贫血的效果、体内溶血情况及对肝肾功能的影响 ;②将含不同基因组拷贝数的鸭乙肝病毒 (DHBV)的人红细胞经静脉感染 1日龄雏鸭。采用同位素核酸杂交法检测鸭血清中DHBVDNA ,计算病毒灭活前后人红细胞中DHBV的半数致死量 (ID50 ) )。结果　①经MB P处理的犬自体红细胞输入Beagle犬体内未发生溶血 ,输血前后谷丙转氨酶 (ALT)、谷草转氨酶 (AST)、尿素、肌酐等与输血前比较无明显差异 ;②经MB P灭活处理后 ,含DHBV红细胞的ID50 由 1 0 3 .3 5变为 1 0 8.3 5拷贝。结论　红细胞MB P病毒灭活是安全有效的。     

以质粒为基础的同源重组技术在葡萄球菌基因敲除中的应用

葡萄球菌是医院内感染的重要病原菌,通过同源重组敲除葡萄球菌的靶基因是研究其功能的重要方法。以质粒为基础的重组系统是外源基因序列传递,发生同源重组的重要载体。近年来,葡萄球菌基因敲除所用的重组质粒的特性取得不断改进。结合本课题组工作,简要综述以质粒为基础的同源重组技术在葡萄球菌基因敲除中的应用及技巧,重点比较不同质粒的特点及使用条件,对于葡萄球菌致病机制研究具有借鉴意义。     

质粒介导16S rRNA甲基化酶肺炎克雷伯菌临床分离株的检测及分子流行病学研究

目的 调查165 rRNA甲基化酶在肺炎克雷伯菌临床分离株中的流行情况.方法 收集我院2006年1月至2007年9月从临床标本中分离的肺炎克雷伯菌337株,所有菌株均为非重复株.菌种鉴定采用全自动微生物分析仪,庆大霉素、阿米卡星和妥布霉素的药敏试验采用琼脂稀释法.超广谱B内酰胺酶(ESBLs)检测采用美国临床和实验窒标准协会(CLSI)规定的纸片确证法.使用PCR检测16S rRNA甲基化酶基因、整合酶基因和ESBL基因.接合试验检测质粒的可转移性;脉冲场电泳分析菌株的同源性.结果 337株肺炎克雷伯菌对庆大霉素、妥布霉素和阿米卡星的耐药率分别为19.0%(64/337)、8.3%(28/337)和16.3%(55/337).21株16S rRNA甲基化酶基因阳性,阳性率为6.2%(21/337),其中13株rmtB阳性、3株armA阳性、5株rmtB和atmA同时阳性.所有16S rRNA甲基化酶基因阳性株对庆大霉素、妥布霉素和阿米卡星同时耐药且都为高度耐药(MICs≥256μL),21株甲基化酶基因阳性株有19株产ESBLs,ESBL基因主要为CTX-M-14-like、CTX-M-15-like和SHV-12-like.21株均为Ⅰ类整合酶基因阳性.13株通过接合试验把质粒传递给受体菌E. coliJ53.所有接合子Ⅰ类整合酶基因阳性、blaTEM-1基因阳性、产ESBLs及对庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星和复方磺胺甲噁唑耐药,对其他抗菌药物敏感.接合子ESBL基因型与供菌一致.21株16S rRNA甲基化酶基因阳性株经脉冲场凝胶电泳(PFGE)分成14个基因型,主要为A型和Ⅰ型.结论 armA和rmtB型16S rRNA甲基化酶基因已经在肺炎克雷伯菌中播散,既可通过克隆株播散也可通过接合性质粒在不同菌株间播散.     

trap基因表达在表皮葡萄球菌生物膜形成及附属基因调节(agr)系统活化中的作用

目的研究表皮葡萄球菌trap基因表达与生物膜形成的相关性及其对agr系统的活化作用。方法采用微量板半定量法检测表皮葡萄球菌生物膜表型,二维电泳和高灵敏度的基质辅助激光解吸附飞行时间质谱分析比较表皮葡萄球菌标准株蛋白质表达谱,实时定量逆转录PCR检测trap基因和RNAⅢ的转录水平,CLUSTALX对表皮葡萄球菌trap基因与金黄色葡萄球菌序列进行分析．Mega软件构建进化树。结果比较分析形成生物膜的表皮葡萄球菌ATCC35984株与不形成生物膜的ATCC12228株生长中期的蛋白质组,发现ATCC35984株的TRAP蛋白量明显高于ATCC12228株。转录水平的检测显示ATCC12228株和生物膜阳性临床SE1457、SE671株的trap基因均低转录,但RNAⅢ的转录水平未降低。SE1457株agr系统突变后,RNAⅢ的转录明显降低,trap基因的转录无变化．RNAⅢ的转录随细菌生长变化而增加,trap基因转录保持不变．trap序列分析显示其在表皮葡萄球菌与金黄色葡萄球菌中较为保守,但存在明显的进化距离。结论在本论文所研究的表皮葡萄球菌菌株中,trap基因的转录和翻译与细菌生物膜的形成不存在直接的调控相关性;并提示TRAP蛋白不是表皮葡萄球菌agr系统活化所必需的细菌产物;表皮葡萄球菌trap基因序列与金黄色葡萄球菌之问存在差异,可能与其功能差异相关。