重组汉坦病毒包膜糖蛋白G1、G2基因体内外表达的评价

目的　构建分别编码汉坦病毒浙 37(Z37)株包膜糖蛋白G1、G2的真核表达质粒 ,并在离体及活体内评价重组汉坦病毒 (HV)包膜糖蛋白G1、G2基因的表达。方法　将编码G1、G2的基因片段分别插入至真核表达载体 pcDNA3.1( ) ,获重组质粒pcDNA3.1 G1、pcDNA3.1 G2。在体外转录翻译系统和真核细胞中表达重组基因 ,并在BALB/C小鼠中评价包膜糖蛋白G1、G2所激发的特异性体液免疫应答效果。结果　重组质粒pcDNA3.1 G1、pcDNA3.1 G2转染COS 7细胞后 ,IFA法可检测到细胞内有特异性荧光分布 ;在体外蛋白质转录、翻译系统 ,重组质粒 pcDNA3.1 G1、pcDNA3.1 G2所表达的蛋白质分子量分别约为 70KD及 5 5KD ;在免疫的部分小鼠体内可检测到特异性抗体。结论　成功地构建了分别编码HVZ37株包膜糖蛋白G1、G2的重组质粒 ,并能在体内外表达     

双组分信号转导系统saeRS对表皮葡萄球菌生存能力的影响

目的 研究不同浓度的葡萄糖对表皮葡萄球菌野生株、saeRS基因删除突变株及回复株生存能力的影响及机制.方法 在BM培养基中添加不同浓度(7.0 mmol/L、14 mmol/L、28 mmol/L、56 mmol/L)的葡萄糖,分析3种表皮葡萄球菌的生存能力、生物膜形成能力、培养基的酸度及抵抗抗生素生存的能力.结果 与表皮葡萄球菌野生株相比,葡萄糖能明显促进saeRS删除突变株的生存能力和生物膜形成能力,但能够明显降低其对抗生素(比如青霉素、苯唑西林、庆大霉素、环丙沙星和丁胺卡那霉素)的抵抗能力;saeRS删除突变株和回复株在14 mmol/L浓度时生存能力最强,在28 mmol/L浓度时生物膜形成能力最强,而葡萄糖浓度对于野生株的生存能力及生物膜形成能力无显著影响.在添加14 mmol/L葡萄糖时,saeRS删除突变株培养基(pH=8.07)的酸度比野生株(pH=7.0)明显降低.结论 SaeRS可能通过介导葡萄糖的利用影响了表皮葡萄球菌的生存能力;双组分信号转导系统saeRS影响抗生素如青霉素、苯唑西林、庆大霉素、环丙沙星和丁胺卡那霉素对表皮葡萄球菌的杀菌作用.     

质粒DNA促进HBsAg-抗HBs复合型疫苗诱生的免疫应答的研究

目的　研究HBsAg 抗HBs 质粒DNA复合型疫苗的免疫原性及其诱生细胞免疫应答的类型。方法　分别以HBsAg、HBsAg 抗 HBs(IC)、pI/AmpHBs、IC pI/AmpHBs及IC pI/Amp免疫小鼠 ,检测抗 HBs的效价 ,分析抗 HBsIgG亚类 (ELISA) ;取免疫小鼠脾细胞 ,体外抗原刺激 ,用竞争性RT PCR方法检测IFN γ及IL 4mRNA转录水平。结果　IC pI/AmpHBs诱生的抗 HBs效价明显高于IC或pI/AmpHBs单独免疫组 ,其IgG2a/IgG1比值高于IC免疫组 ,而低于pI/AmpHBs免疫组。IC pI/AmpHBs免疫小鼠脾细胞在HBsAg刺激下 ,IFN γmRNA转录水平明显高于其他免疫组 ,其IFN γmRNA的T/C(目的片段Target/竞争片段Competitor)比值为IC免疫小鼠脾细胞的 10倍 ;IC pI/AmpHBs免疫小鼠脾细胞IL 4mRNA转录水平亦高于其他免疫组 ,其IL 4mRNA的T/C比值为IC免疫小鼠脾细胞的 2倍。结论　HBsAg 抗HBs 质粒DNA复合型疫苗在增强体液免疫应答的同时可诱导脾细胞IFN γ的表达水平增高。     

一种高效的葡萄球菌基因敲除方法的建立与应用

目的 建立一种高效构建葡萄球菌基因敲除突变株的方法。方法 通过融合PCR将vraSR操纵子上、下游同源片段连接起来;通过基于位点特异性重组的Gateway克隆技术将融合PCR产物连接入温度敏感型穿梭质粒pKOR1,转化修饰缺陷型大肠杆菌DC10B,获得同源重组质粒pKOR1-vraSR;电转化表皮葡萄球菌RP62A株;在高温和氯霉素双重选择压力下,质粒通过第1次同源重组整合到表皮葡萄球菌染色体上;转移到无抗生素的培养基中继续培养,发生第2次同源重组;将菌液涂布于含1 μg/mL脱水四环素的培养基上进行反向筛选,那些未发生重组的整合菌株因表达必需基因secY的反义RNA而无法生存,最后,挑取菌落通过PCR进行鉴定。结果 成功构建了难以转化的表皮葡萄球菌RP62A株的vraSR基因敲除突变株。结论 利用大肠杆菌DC10B和穿梭质粒pKOR1对葡萄球菌进行基因敲除的方法简便高效,适用的范围更广泛。     

异氟醚对人肺泡巨噬细胞趋化因子和细胞因子mRNA表达的影响

目的　研究异氟醚麻醉中人肺泡巨噬细胞IL 8、IL 1β、TNF α、IFN γ、IL 4和IL 10mRNA的表达 ,探讨异氟醚对肺炎性反应的影响。方法　 2 4例肝脏部分切除手术病人随机分为异氟醚组 (n =12 )和对照组 (n =12 ) ,在麻醉诱导后即刻和 4h分别用纤维支气管镜行支气管肺泡灌洗 ,从灌洗液中收获肺泡巨噬细胞提取RNA ,逆转录合成cDNA以 β actin为内对照作PCR后电泳扫描求积 ,检测肺泡巨噬细胞上述细胞因子、趋化因子mRNA的表达。结果　异氟醚组麻醉诱导后 4h比麻醉诱导后即刻IL 8、IL 1βmRNA的表达显著增加 (P <0 .0 5 ) ,对照组麻醉诱导后 4h比麻醉诱导后即刻IL 8、IL 1βmRNA的表达轻度增加 (P <0 .0 5 ) ;在麻醉诱导后4h ,异氟醚组和对照组之间IL 8、IL 1βmRNA的表达水平差异有显著意义 (P <0 .0 5 )。TNF α、IFN γ、IL 4和IL 10mRNA的表达在麻醉前后无明显变化。结论　异氟醚能增强病人肺泡巨噬细胞促炎性细胞因子、趋化因子mRNA的表达 ,提示异氟醚可能加重肺部的炎性反应     

复合麻醉对人外周血淋巴细胞促炎性细胞因子mRNA表达的影响

目的 研究复合麻醉中人外周血淋巴细胞IL－8、IL－1β、TNF-α基因表达，探讨异氟醚吸入和硬膜外阻滞对外周血炎性反应的影响。方法 24例肝脏部分切除手术病人随机分为异氟醚组（n＝12）和硬膜外组(n=12），在麻醉诱导后即刻和4小时分别取静脉血20ml用外周血淋巴细胞分离液（Ficoll）进行梯度离心，从获得的淋巴细胞中提取RNA，逆转录合成cDNA,PCR后电泳扫描求积，检测淋巴细胞IL－8、IL-1β和TNF－α的mRNA表达。结果 异氟醚组麻醉维持4小时比麻醉诱导后即刻IL－8、IL－1β的表达增加（P＜0.05），硬膜外组麻醉维持4小时与麻醉诱导后即刻IL－8、IL－1β的表达无明显变化（P＞0.05）。两组均未检出TNF－α基因表达。结论 复合麻醉中吸入异氟醚能增强肝脏部分切除病人外周血淋巴细胞促炎性细胞因子mRNA表达，即在转录水平上，异氟醚能增强外周血炎性反应；而硬膜外阻滞无此效应。     

聚合酶链反应检测汉坦病毒感染的实验研究

目的 早期诊断汉坦病毒感染。方法 根据国际标准株（７６－１１８,３９）Ｍ基因Ｇ１区设计两对公有引物和一条探针,按异硫酸氰胍－酚一步法提取汉坦病毒ＲＮＡ,采用ＲＴ－ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ检测病毒细胞培养上清原液及稀释液、１６份对照组血清、４０份ＨＦＲＳ急性期（１～５天）血清标本中的汉坦病毒ＲＡＮ,所有扩增产物采用Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ或Ｄｏｔ ｂｌｏｔ证实其特异性。结果 汉坦病毒细胞培养液和４０份     

表皮葡萄球菌双组分信号转导系统arlS基因生物学功能研究

目的探讨表皮葡萄球菌arlSIR双组分信号转导系统（two-component signal transduction system，TGS）的组氨酸激酶arKS基因删除对细菌生物学的影响。方法构建含有红霉素抗性基因（ermB）的pBT2-AarlS质粒，随后将电转入表皮葡萄球菌1457的重组质粒在43℃条件下振摇培养，筛选表皮葡萄球菌1457菌株的ads缺失突变株（SEl457-△arlS）；采用微量板半定量方法检测arlS删除突变对细菌生物被膜形成的影响，通过检测A595值观察其生长曲线，检测过夜培养上清液对菌细胞裂解均活性，并用0．1％Triton X-100诱导细菌自溶的方法检测SEl457-△ar／S突变株的自溶情况。结果成功构建pBT2．AarLS质粒，利用同源重组基因删除的方法表皮葡萄球菌1457 arlS基因被删除。AarlS突变株与野生株的生长曲线基本相似，提示adS基因删除对细菌的增殖无明显影响，但SEl457．AadS突变株形成生物被膜的能力明显低于野生株，降低90．96％；在0．1％TritonX-100诱导下SEl457．△arlS基因删除突变株的裂解率为97．83％，野生株为55．38％；而△arlS突变株过夜培养上清液对靶细菌裂解的活性则低于野生株，其裂解率为20．50％，野生株为56．12％。结论表皮葡萄球菌arLS／R双组分信号转导系统arlS基因可调控细菌生物被膜形成、菌细胞自溶以及胞外细菌裂解酶的活性。     

质粒介导16S rRNA甲基化酶在奇异变形杆菌临床分离株的流行情况研究

到目前为止,在革兰阴性杆菌中已发现AnnA、RmtA、RmtB、RmtC、RmtD和NpmA 6种16S rRNA甲基化酶,且编码这些酶的基因通常和超广谱β-内酰胺酶(ESBL)基因共处一个质粒上,通过质粒在不同的菌株之间播散[1-]4.RmtC型16S rRNA甲基化酶首次在奇异变形杆菌中被发现[4],但16S rRNA甲基化酶在奇异变形杆菌中的流行情况还不清楚.本研究的目的是对从我院2004年5月至2007年9月临床标本中分离的198株奇异变形杆菌进行16SrRNA甲基化酶筛查,并对其转移机制进行研究,现将结果报道如下.     

抗HBs-HBsAg复合物诱生体液免疫应答的研究

目的研究抗ＨＢｓ－ＨＢｓＡｇ复合物在ＢＡＬＢ／ｃ小鼠诱生体液免疫应答的特点。方法分别用鼠抗ＨＢｓ－ＨＢｓＡｇ免疫原性复合物（ＩＣ）或单独ＨＢｓＡｇ免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠（加或不加氢氧化铝），分析其诱生的抗ＨＢｓＩｇＧ效价及ＩｇＧ亚类。结果用ＩＣ加氢氧化铝为佐剂免疫小鼠诱生的抗ＨＢｓ中以ＩｇＧ１亚类为主，而用ＨＢｓＡｇ免疫鼠则以ＩｇＧ２ｂ亚类较高。ＩＣ不加氢氧化铝佐剂诱生的抗ＨＢｓ中ＩｇＧ１及ＩｇＧ２ａ均高于单独ＨＢｓＡｇ免疫鼠。研究还显示，抗ＨＢｓＩｇＧＦｃ段是巨噬细胞（ＭΦ）等抗原提呈细胞摄取ＩＣ的主要途径。结论抗ＨＢｓ－ＨＢｓＡｇ复合物免疫诱生的体液免疫应答较单独ＨＢｓＡｇ免疫强。抗ＨＢｓ主要通过Ｆｃ段的介导作用，改变了机体抗原提呈细胞对ＨＢｓＡｇ的摄取、加工及抗原提呈，并可增强ＨＢｓＡｇ的免疫原性。