肝硬化患者血细胞内氨基酸检测的临床研究

采用日立８３５－５０型高速自动氨基酸分析仪，测定肝硬化患者血细胞内氨基酸，结果显示；１．肝硬化红细胞内天门冬，缬，异亮，亮和组氨酸降低、丝谷，甘酪，苯丙，精和脯氨酸明显增高。２．肝硬化白细胞内氨基酸谷，缬，亮和脯氨酸降低，苏，丝，丙异亮，苯丙，酪，组和精氨酸增高。３．肝硬化血细胞支／芳比值与血浆相同均降低，但红细胞内有５种氨基酸增高使总量增加２０７．８６μｍｏｌ／Ｌ；白细胞有１３种增谢３０２．６８     

自发性流产小鼠模型主动脉旁淋巴结CD45+CD86+细胞亚群分析

目的：检测主动脉旁淋巴结(PLN)CD45+CD86+细胞，用于间接分析小鼠母-胎界面局部免疫状况。 方法： CBA/J×DBA/2、未孕CBA/J雌鼠和CBA/J×BALB/c小鼠分别作为自发性流产模型（A组）、未孕对照（N组）和生育力正常对照（F组）。采用流式细胞术检测CD45+CD86+细胞在CD45+细胞中的百分率（简称CD45+CD86+百分率）和这些细胞的绝对数，其中单个核细胞从孕5.5、9.5和13.5 d小鼠PLN和孕13.5 d胎盘分离获得。为鉴定CD86+细胞所属类型，采用CD3、CD19和DX5分别作为T细胞、B细胞和NK细胞特异性标志物进行流式细胞检测。 结果： A组胚胎吸收率和绝对数(29.3%, 1.8±1.0)均显著高于F组(4.8%, 0.3±0.5, P<0.01)。相应地，A组孕13.5 d PLN CD45+CD86+细胞百分率和绝对数也均显著高于F组(分别为27.5%±14.0% vs 12.3%±7.1%和1 362±687 vs 615±353, P<0.01)。未孕CBA/J雌鼠PLN CD45+CD86+百分率为7.5%，与孕5.5 d A组小鼠相近(10.6%)，至孕9.5 d时显著升高至23.9%(与未孕鼠相比，P<0.01；与孕5.5 d小鼠相比，P<0.05)，并保持高水平直至13.5 d(27.5%)。相反，在CBA/J×BALB/c小鼠孕期未观察到这种趋势。 结论： CBA/J×DBA/2小鼠流产开始发生于孕9.5 d，此时CD45+CD86+细胞数增多，提示这些细胞与胚胎吸收相关。从PLN中分离淋巴细胞进行表型分析，有助于间接评价母-胎界面局部免疫状况。     

脐血和外周血单个核细胞培养上清影响HIV-1感染的体外实验研究

目的：体外研究脐血和外周血单个核细胞（CBMC和PBMC）培养上清对HIV-1感染的影响，为发现抗HIV-1的可溶性因子奠定基础。 方法： PHA刺激CBMC和PBMC后5 h和12 h收集上清，加入荧光标记的HIV-1ⅢB/H9和MT-2细胞培养体系中，2 h后在倒置荧光显微镜下观察其对细胞融合的影响；用Luminex 100TM分析仪检测收集上清中细胞因子含量。 结果： PHA刺激CBMC和PBMC后5 h和12 h的上清均可抑制HIV-1ⅢB/H9和MT-2细胞融合，同一时间收集的PBMC和CBMC上清对HIV-1ⅢB/H9和MT-2细胞融合的抑制作用无差异，但5 h上清的抑制作用强于12 h的上清；CBMC 5 h上清中促炎症细胞因子比PBMC 5 h上清为低，而CCR5配体MIP-1α和RANTES则比PBMC 5 h上清高，差异显著（P＜0.05）。 结论： 通过脐血和外周血单个核细胞可以制备有效抗HIV感染的可溶性因子，可能为艾滋病治疗药物提供新的来源。     

茴香霉素对小鼠T细胞反应性及其杀伤作用的影响

目的 茴香霉素对小鼠T细胞活化、反应性、杀伤作用及其同种异基因皮肤移植的影响.方法 利用荧光标记的单克隆抗体双染技术结合流式细胞仪检测茴香霉素对小鼠CD3 T细胞早期及中期活化标志分子CD69和CD25表达的影响; 用MTT法检测茴香霉素刺激下T细胞在单向或双向混合淋巴细胞反应中T细胞的反应性及其对大鼠肝癌(7919)细胞的杀伤效应;建立小鼠同种异基因皮肤移植动物模型,观察茴香霉素对移植皮肤存活时间的影响.结果 在最佳剂量10.0 ng/mL时,茴香霉素能够明显抑制T细胞表面分子CD69和CD25的表达,且能抑制单向或双向混合淋巴细胞反应中T细胞的反应性(P＜0.01);10.0 ng/mL茴香霉素亦能明显抑制T细胞对大鼠肝癌细胞的杀伤效应(P＜0.01);5.0和15.0 mg/kg茴香霉素能够明显延长小鼠移植皮肤的存活时间 (P＜0.01).结论 茴香霉素对T 细胞的活化、反应性、杀伤效应及同种异基因皮肤移植排斥反应均有明显抑制作用,可能为治疗免疫反应性疾病提供新的策略 .     

上海市某社区脑卒中高危人群的危险因素现状分析

目的:了解和掌握本社区农村35岁以上常住居民脑卒中高危人群危险因素的分布状况,为本社区建立脑卒中高危人群干预体系提供依据.方法:采用分层随机抽样的方法,抽取本社区15个村的35岁以上常住居民共1694例,其中男性679人(40.1%),女性1015人(59.9%).脑卒中风险初筛评估危险因素包括高血压、血脂异常、糖尿病、房颤、吸烟、超重肥胖、缺少锻炼和脑卒中家族史等.结果:共有500人符合脑卒中高危对象标准,高危对象检出率为29.5%.男性的检出率高于女性(35.9%比25.2%,P<0.05).70岁及以上人群中的高危对象检出率最高,36~49岁人群的检出率最低(P<0.05).在高危对象中,脑卒中危险因素流行率的顺位为高血压86.8%,超重或肥胖46.2%,糖尿病38.6%,吸烟31.2%,缺少体育锻炼27.8%,血脂异常14.4%,房颤13.6%.女性高危对象中房颤和糖尿病的流行率高于男性(P<0.05).吸烟是男性高危对象的主要危险因素(61.9%).不同年龄组间缺少体育锻炼和超重或肥胖的流行率有明显差异(P<0.05).结论:本社区有较高比例的脑卒中高危人群;应针对不同性别和年龄的人群开展有针对性地健康教育及干预措施,积极防治高血压、糖尿病等慢性病,鼓励合理饮食,多参加体育活动,以减少社区人群发生脑卒中的风险.     

阻断ERK途径对地塞米松诱导胸腺细胞凋亡中线粒体膜电势的影响

目的： 研究阻断ERK途径对地塞米松（DEX）诱导的胸腺细胞凋亡中线粒体膜电势的影响。 方法： 利用PD098059（PD）阻断小鼠胸腺细胞ERK途径，分别设对照组（control）、单纯PD组（PD only）、DEX组和PD＋DEX组；在3 h、5 h和7 h时点，利用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术检测细胞凋亡；在3 h、7 h和11 h，利用JC-1染色流式细胞术检测线粒体膜电势（△ψm）变化。 结果： 在1 μmol·L-1 DEX刺激下，小鼠胸腺细胞在3 h、5 h和7 h凋亡率分别为(19.63±0.35)%、(41.84±1.67)%和(67.00±2.43)%，对照组分别为(4.98±0.39)%、(6.08±0.33)%和(9.31±0.34)%，差异显著（P<0.01）；相同时点下，PD only组细胞凋亡率分别为(7.95±0.60)%、(10.69±0.48)%和(22.20±1.24)%，显著高于对照组（P<0.01）；PD＋DEX组在3 h和5 h时点细胞凋亡率显著高于DEX组（P<0.01），而在7 h时点，两组差异不显著（P>0.05）。在3 h、7 h和11 h，DEX组△ψm降低的细胞比率分别为(21.23±1.43)%、(55.34±1.78)%和(70.88±2.87)%，对照组分别为(5.25±1.22)%、(8.01±0.97)%和(12.88±1.10)%，差异显著（P<0.01）；相同时点下，PD only组△ψm降低的细胞比率分别为(11.09±2.00)%、(16.21±2.25)%和(21.15±3.70)%，显著高于对照组（P<0.01）；PD＋DEX组在3 h和5 h时点细胞凋亡率显著高于DEX组，分别为(30.55±2.99)%和(65.22±4.32)%（P<0.01），11 h时点两组差异不显著（P>0.05）。 结论： DEX诱导小鼠胸腺细胞凋亡至少部分通过ERK途径，阻断ERK途径在该凋亡过程中具有重要生物学意义。     

地塞米松介导胸腺细胞凋亡过程中线粒体和细胞结构蛋白的变化

目的：研究地塞米松(DEX)介导的小鼠胸腺细胞凋亡过程中线粒体质量和结构蛋白变化特点。 方法： 以地塞米松（DEX）诱导小鼠胸腺细胞凋亡为模型，利用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术研究细胞凋亡和坏死，JC-1染色流式细胞术检测线粒体膜电势（△Ψm）和线粒体质量，利用CFDA-SE染色流式细胞术检测细胞结构蛋白变化。 结果： 在1×10-6mol/L DEX诱导下，小鼠胸腺细胞在6 h凋亡比率为(51.25±5.51)%，对照组为(12.03±2.00)%，差异显著（P<0.01）； DEX组坏死比率为(30.25±3.67)%，对照组为(10.11±1.11)%，差异显著（P<0.01）。DEX组在6h时点的线粒体质量显著低于对照组（P<0.01），FL1平均荧光强度分别为（561.62±54.27）和（900.25±38.80）。DEX同时引起线粒体膜电势的显著下降（P<0.01），对照组FL2平均荧光强度为（267.51±26.48），DEX组为（133.17±12.29）。成熟T细胞培养48 h，CFDA-SE法仅检测到亲代单一细胞峰；而在Con A刺激条件下出现3个子代峰。对照组小鼠胸腺细胞在CFDA-SE染色培养6 h条件下，存在(5.25±1.15)％的低荧光强度细胞群，而在DEX刺激下，该群细胞占（47.39±9.76）％，并且在直方图结果上形成明显的细胞峰。 结论： DEX诱导小鼠胸腺细胞凋亡过程中，线粒体质量和细胞结构蛋白均有所下降；CFDA-SE染色流式细胞术可以作为基于细胞结构蛋白变化的凋亡定量检测方法。     

地塞米松影响小鼠胸腺细胞c-Myc表达以及凋亡研究

目的: 研究在地塞米松(DEX)诱导的小鼠胸腺细胞凋亡过程中c-Myc信号变化特点及其与下游caspase-3变化的相关性,以进一步探讨c-Myc在小鼠胸腺细胞凋亡过程中的作用机制。方法:以终浓度1 μmol/L地塞米松诱导小鼠胸腺细胞凋亡,通过Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术测定30 min、3 h、6 h和9 h凋亡和坏死细胞比率,在6 h时点电镜观察细胞形态,利用SDS-PAGE及Western blot检测0 min、30 min、1 h和3 h细胞内c-Myc和caspase-3信号变化特点。结果:在1μmol/L DEX诱导下,小鼠胸腺细胞在30 min、3 h、6 h和9 h凋亡比率分别为(5.70±0.46)%、(35.79±1.13)%、(50.61±2.15)%和(35.52±1.66)%,对照组分别为(5.97±0.25)%、(10.20±0.71)%、(12.10±0.66)%和(15.45±0.51)%,组间差异显著(P＜0.01)。相应DEX组坏死比率分别为(4.58±0.51)%、(4.66±0.67)%、(25.36±1.64)%和(46.99±2.67)%,对照组分别为(4.38±0.39)%、(4.19±0.73)%、(9.63±1.25)%和(13.38±0.72)%,组间差异显著(P＜0.01);电镜观察结果显示DEX处理6 h见较多典型凋亡细胞。对照组在0 min即可检测到c-Myc的明显表达,30 min略见增多,1 h和3 h呈微弱的下降趋势;DEX组c-Myc在0 min表达强于对照组,30 min最强,而在1 h和3 h显著减弱;对照组caspase-3随培养时间延长而逐渐增多,而DEX组caspase-3在0 min表达增多,30 min最多,而在1 h和3 h显著减少。结论:本研究结果提示DEX诱导的小鼠胸腺细胞凋亡呈现c-Myc介导的细胞凋亡模式,而且在该过程中c-Myc和caspase-3信号存在着反馈抑制调节的可能性。     

NO介导的小鼠胸腺细胞中线粒体的变化在细胞凋亡过程中的作用

目的研究一氧化氮(NO)介导的胸腺细胞凋亡中线粒体膜电位(ΔΨm)和心磷脂(CL)含量变化的特点。方法以S-亚硝基-N-乙酰青霉胺(SNAP)作为NO的供体诱导胸腺细胞凋亡,以地塞米松(DEX)作为阳性对照药物;设空白对照组、SNAP组和DEX组3个实验组;经膜联蛋白V(annexinVmAb)和碘化丙啶(PI)染色后,用流式细胞术(FCM)检测细胞磷脂酰丝氨酸(PS)外翻;用3,3’-二已基噁羰花青碘化物[DiOC6(3)]和PE-anti-annexinVmAb检测凋亡中ΔΨm变化;用壬基吖啶橙(NAO)和PE-anti-annexinVmAb检测凋亡中线粒体CL变化。结果SNAP作用后6h,胸腺细胞出现典型的细胞凋亡特征,多数annexinV阳性的细胞出现皱缩。DEX组ΔΨm降低且未凋亡的细胞比例显著高于空白对照组(P<0.01);而SNAP组该群细胞所占比例与空白对照组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。各组中约40%~50%的DiOC6(3)阴性细胞同正常细胞的大小。SNAP组CL含量降低的凋亡细胞所占比例显著高于对照组(P<0.01),未见CL含量降低且未凋亡的细胞群。空白对照组和SNAP组中分别有(48.32±3.96)%、(43.64±4.90)%的细胞CL含量降低但大小同正常细胞。结论NO介导的小鼠胸腺细胞的凋亡过程,依次为磷脂酰丝氨酸外翻、线粒体去极化、CL氧化及细胞皱缩。同DEX模型组相比较,NO介导的小鼠胸腺细胞线粒体的变化为凋亡过程中较晚期的变化。     

一种分离、培养扩增小鼠NK细胞方法的建立

目的:建立小鼠NK细胞的分离及培养扩增的方法。方法:用两步黏附分离法和磁珠活化的细胞分选(MACS)法,从小鼠脾脏的单个核细胞(MNC)中分离NK细胞,计数所得细胞的总数,并用FITC抗小鼠CD3和PE抗小鼠NK1.1单克隆荧光抗体染色后,用流式细胞仪(FACS)检测NK细胞的纯度。以YAC -1为靶细胞,用MTT比色法检测NK细胞的杀伤活性。结果:将两步黏附分离法分离的2×107个脾MNC培养5、10、15、20d,计数细胞的总数并检测CD3-NK1.1 细胞百分率,分别为0.5×107、1.4×107、2.6×107、3.0×107和18.36%、43.44%、55.68%、60.03%。效靶细胞25∶1时,NK细胞的杀伤率分别为54.38%、66.54%、79.38%和83.86%,明显高于脾MNC(41.93%)(P<0.01)。MACS法纯化前后细胞的总数和CD3-NK1.1 细胞的百分率,分别为1.0×108、1.5×106和2.54%、93.60%;但纯化后的细胞在体外培养20d时,只扩增到1.9×106个。结论:用两步黏附分离法分离的小鼠NK细胞,培养2～3wk可获得大量的NK细胞,纯度可达55%～60%;在效靶细胞为25∶1时,NK细胞对YAC1细胞的杀伤率约为80%。