表达胞壁结合型贝氏柯克斯体27 000外膜蛋白的重组卡介苗构建

目的：构建能够表达胞壁结合型贝氏柯克斯体27000外膜蛋白的重组卡介苗。方法：用PCR技术从卡介苗基因组扩增分枝杆菌19000抗原的细胞壁结合区基因和从贝氏柯克斯体基因组扩增27000外膜蛋白基因，将它们分别插入大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒(pSMT3)的XbαⅠ／BamHⅠ和BarnHⅠ／HindⅢ位点。将重组的穿梭质粒转化大肠杆菌并从大肠杆菌提取重组穿梭质粒转化卡介苗。结果：从含潮霉素的培养基筛选到具有该抗生素抗性的重组卡介苗菌落，用免疫印迹分析重组质粒转化的卡介苗，发现一约27000的蛋白带与贝氏柯克斯体27000重组蛋白免疫兔血清发生特异性反应；27000重组蛋白免疫兔血清做间接免疫荧光检测重组卡介苗，结果为阳性。结论：重组卡介苗能表达贝氏柯克斯体27000外膜蛋白，表达的27000外膜蛋白存在于卡介苗菌体表面，卡介苗菌体表面的27000抗原可能诱导抗Q热免疫应答。     

立克次体的16SrRNA基因序列分析

目的　研究立克次体的１６ＳｒＲＮＡ基因序列的差异,为其分类和鉴定提供依据。方法　从基因数据库中选择不同的立克次体属代表种的１６ＳｒＲＮＡ基因序列,在计算机上用多序列排列程序对序列进行同源位排列和对比分析,以及依据序列的相似程度构建进化树。结果　立克次体的１６ＳｒＲＮＡ基因含有４ 个高变区,这些高变区的序列具有种或属的特异性,依据序列的相似程度构成的进化树可将立克次体目内成员分为柯克斯体、巴通体、立克次体、埃立克体等４ 个大基因群,每个大基因群含有若干个小基因群。结论　１６ＳｒＲＮＡ基因高变区的序列可用于设计立克次体种、属特异性ＰＣＲ引物和杂交探针;１６ＳｒＲＮＡ 基因序列的分析是目前立克次体分类和鉴定的最可靠依据     

查菲埃立克体120 000表面抗原蛋白基因的克隆与表达

目的 构建查菲埃立克特异性表面抗原P120基因的原核表达质粒,并使该基因在E.coli中高效表达。方法 依据查菲埃立克体P120基因序列设计一对特异性引物,用PCR从查菲埃立体克体的基因中扩增含有编码P120原决定簇的基因片段,而后将PCR产物用T载体克隆。用酶将PCR产物从T载体切下,将它定向插入原核表达质粒PET11C构建PET11C／p120基因。PET12C／p120重组质粒转化的E．coli在TPTG的诱导下产生一分子量为41000的天然蛋白,它的产量占细菌蛋白总量的28％,用免疫印迹分析证明它能特异地与查菲埃立体克感染病人血清反应。结论 查菲埃立克体特异性的P120抗原在原核表达系统被高效表达,该抗原的研制成功为制备人单核细胞埃立克体病诊断抗原和疫苗奠定了基础。     

用16S rRNA基因序列分析从西藏的微小牛蜱中检出的埃立克体

用埃立克体属特异性套式PCR和DNA序列测定从西藏微小牛蜱检出边缘无形体和埃立克体;用半套式PCR扩得该埃立克体的16S rRNA基因,并测定了它的序列;将该埃立克体的16S rRNA基因序列与其它埃立克体的16S rRNA基因序列进行对比分析,结果证明它的16S rRNA基因与埃立克体属的犬埃立克体群16S rRNA基因相似水平最高(97%～98%);用16S rRNA基因序列做系统发育分析,结果显示该采自西藏的微小牛蜱的埃立克体可能是与查菲埃立克体密切相关的一种新埃立克体.     

贝氏柯克斯体30kD外膜蛋白基因表达及免疫保护性的研究

贝氏柯克斯体可引起人类急、慢性Q热。急性Q热临床表现多种多样,主要症状为发热、头痛和肌肉酸痛,并常伴有肺炎、肝炎等。慢性Q热常发展为Q热性心内膜炎、骨髓炎。Q热疫苗是预防Q热流行的最有效手段,目前人用Q热疫苗是灭活的柯克斯体。虽然灭活疫苗的免疫保护效果很好,但注射该疫苗接种部位常出现不良反应。研究发现,在贝氏柯克斯体的Ⅰ相和Ⅱ相中含有相对分子质量(Mr)为30×10 3 的外膜蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性〔1〕。我们采用分子生物学技术,研制出贝氏柯克斯体Mr30×10 3 重组外膜蛋白,用重组蛋白免疫小鼠,对其免…     

立氏立克次体蛋白抗原基因的表达和重组蛋白抗原的免疫印迹分析

目的表达立氏立克次体(Rickettsia rickettsii)主要抗原基因,免疫印迹初步分析重组蛋白抗原的抗原性。方法根据立氏立克次体全基因组序列选出主要抗原相关基因,采用PCR从全基因组中扩增抗原相关基因,将扩得的基因片段插入原核表达质粒构建抗原基因重组表达质粒,将重组质粒转化大肠杆菌并诱导转化菌表达重组蛋白抗原。采用立氏立克次体感染的豚鼠血清和斑点热患者血清分别与纯化的重组蛋白抗原做免疫印迹分析。结果经PCR扩增后获得43个目的基因片段,其中36个基因片段在大肠杆菌中高效表达重组蛋白抗原,其中5个蛋白抗原在免疫印迹中与感染豚鼠血清和斑点热患者血清反应均为阳性。结论免疫印迹筛选出5种立氏立克次体重组蛋白抗原,结果提示它们是能够诱导机体产生特异性免疫应答的主要抗原,可作研制斑点热诊断试剂或亚单位疫苗的新候选蛋白抗原。     

氯仿-甲醇提取贝氏柯克斯体组分Q热疫苗的安全性评价

目的评价采用国内分离株研制的氯仿-甲醇提取贝氏柯克斯体组分Q热疫苗(CMRV)的安全性。方法分别用3批CMRV和灭活贝氏柯克斯体Q热疫苗(WCV)致敏豚鼠,4w后用相同疫苗对致敏豚鼠作皮肤试验。结果CMRV致敏豚鼠与WCV致敏豚鼠的皮试点红肿大小在皮试后1～6d无显著差异,但是从第7d开始,差异显著。皮试后第14d采集接种部位组织做病理切片,WCV致敏豚鼠皮试点的表皮组织有局灶性变性、坏死,并见大量炎性细胞浸润。CMRV致敏豚鼠的皮试点组织基本正常,少数豚鼠偶见局灶性变性,但无坏死现象。3批CMRV致敏豚鼠皮试点组织病变程度相似,均显著轻于WCV致敏豚鼠。结论采用国内分离株研制的氯仿-甲醇提取贝氏柯克斯体组分Q热疫苗的免疫副作用显著轻于灭活Q热疫苗,具有更好的安全性。     

实时荧光定量PCR检测莫氏立克次体

目的 采用TaqMan-MGB探针建立检测莫氏立克次体的实时荧光定量PCR.方法 依据莫氏立克次体外膜蛋白B基因(ompB)设计引物和探针,以克隆的ompB作模板建立实时荧光定量PCR方法.结果 建立的定量标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.995);该方法能检出＜10拷贝的莫氏立克次体DNA,敏感性为普通PCR的1 000倍.用该方法检测莫氏立克次体DNA,结果为阳性,但是检测其他相关细菌DNA的结果均为阴性.用该方法检测莫氏立克次体感染豚鼠血标本,50%样本检测为阳性,而普通PCR检测结果均为阴性.结论 该实时荧光定量PCR具有很高的特异性和敏感性,适合于快速检测样本中微量莫氏立克次体DNA,可用于临床实验室快速确诊地方性斑疹伤寒.     

检测贝氏柯克斯体的实时荧光定量PCR

目的采用新型TaqMan-MGB探针建立检测贝氏柯克斯体的实时荧光定量PCR(real-timequantitativePCR)方法。方法根据贝氏柯克斯体特异的23SrRNA插入基因序列设计引物和探针,以克隆的23SrRNA插入基因片段作DNA模板,在荧光定量PCR检测仪(ABI7900型)上建立实时荧光定量检测方法。结果建立的定量标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好的线性关系(r=0.997);与套式PCR相比较,荧光定量PCR检测敏感性是其100倍。用荧光定量PCR检测其它相关立克次体,检出结果均为0。用荧光定量PCR检测贝氏柯克斯体感染的小鼠脾脏标本,脾脏中贝氏柯克斯体的感染量与感染过程具有相关性。结论本研究建立的检测贝氏柯克斯体的实时荧光定量PCR具有很高的特异性和敏感性,特别适合样本中微量贝氏柯克斯体DNA的检测,其定量检测可用于动物实验中的贝氏柯克斯体感染程度的分析。     

Q热疫苗研究

Q热(Q fever)为一种世界性分布的重要人兽共患病,疫苗接种是预防Q热的最有效手段。专性细胞内寄生的贝氏柯克斯体是Q热的病原体,灭活I相贝氏柯克斯体Q热疫苗(WCV)免疫保护效能几乎为100%,但是其免疫副反应强。氯仿-甲醇提取贝氏柯克斯体(CMR)和三氯醋酸提取贝氏柯克斯体可溶性抗原(TCA)Q热疫苗保留灭活Q热疫苗的免疫保护效能,且免疫副反应显著减轻。但CMR和TCA Q热疫苗均需要用鸡胚大量培养贝氏柯克斯体,需要在高等级生物防护实验室采用复杂步骤提取、纯化贝氏柯克斯体,这些使Q热疫苗的生产成本高、批量生产难。近十年来,国内外Q热疫苗研究着力于分子疫苗,并已经由研究贝氏柯克斯体保护性抗原转移到筛选能诱导特异性细胞免疫应答的CD4⁺和CD8⁺T细胞表位上,以期望T细胞表位在机体内高效表达,诱导机体产生良好的抗Q热保护性免疫应答。