氯仿-甲醇提取贝氏柯克斯体残存组分Q热疫苗的免疫原性及免疫保护性研究

目的实验评价氯仿-甲醇提取贝氏柯克斯体残存组分(CMR)疫苗的免疫特性及免疫保护性。方法采用国内分离贝氏柯克斯体新桥株制备CMR疫苗,用CMR免疫Balb/c小鼠;采用间接免疫荧光法检测CMR免疫小鼠血清特异性抗体水平和用淋巴细胞增殖试验评价CMR疫苗体外刺激小鼠脾细胞增殖的能力;以贝氏柯克斯体攻击免疫小鼠和用贝氏柯克斯体特异的荧光定量PCR检测感染小鼠血和脾脏样本。结果CMR免疫第4周起,小鼠血清中检出高水平的特异性抗体,CMR加氢氧化铝佐剂免疫小鼠的血清特异性抗体显著高于未加佐剂组。CMR在体外刺激正常小鼠和免疫小鼠脾淋巴细胞增殖水平显著高于对照组,WCV则抑制正常脾淋巴细胞增殖。三种剂量(30μg、10μg、1μg/只)CMR免疫小鼠血和脾脏样本贝氏柯克斯体含量显著低于未免疫组,以30μg组及加佐剂免疫小鼠的样本含菌量更显著低于对照组。结论采用我国分离株制备的CMR疫苗能诱导机体产生高效特异性体液免疫和细胞免疫应答,使机体抵抗大剂量的贝氏柯克斯体感染,具有良好的免疫原性和免疫保护性;氢氧化铝佐剂能显著增强CMR疫苗的免疫保护效能。     

贝氏柯克斯体热休克蛋白B基因的克隆与表达

目的克隆贝氏柯克斯体(Coxiellaburnetii)热休克蛋白B(HspB)基因并在大肠杆菌细胞内高效表达。方法采用PCR方法,从贝氏柯克斯体新桥株基因组DNA中扩增出HspB的基因片段,鉴定后将目的片段与原核表达载体pQE30连接,构建重组表达质粒pQE30/hspB,IPTG诱导该重组质粒转化的大肠杆菌产生HspB重组蛋白。结果(1)PCR扩增获得长约1556bp的hspB基因片段。(2)SDS-PAGE证明,HspB重组蛋白的分子量为53.7kDa。(3)经薄层扫描分析,表达蛋白约占全菌体蛋白的71.2%。结论贝氏柯克斯体hspB基因在大肠杆菌中获得了高效表达,为Q热疫苗的研制提供了一易于获得的候选蛋白分子。     

Q热立克次体单克隆抗体的产生及其特性的研究

Q热立克次体存在相变异的现象。随着相变异的出现,Q热立克次体的生物学特性、理化性质和抗原性等方面均有变化。这种变化的发生与Q热立克次体的表面结构和抗原组分的改变有密切关系。为了在分子水平上研究Q热立克次体,阐明相变异的机制或研究Q热立克次体的致病性、血清免疫学     

THP-1细胞吞噬贝氏柯克斯体后的比较蛋白质组学研究

目的采用比较蛋白质组学方法研究了人类单核细胞THP-1感染贝氏柯克斯体后蛋白质表达谱的差异变化。方法利用双向电泳（2-DE）技术对吞噬了毒力株贝氏柯克斯体的THP-1细胞和未吞噬贝氏柯克斯体的THP-1细胞总蛋白进行分离，两组间差异蛋白点利用基质辅助激光解析／电离串联飞行时间质谱技术进行鉴定。每个蛋白质点的肽指纹图谱均使用Mascot在NCBInr蛋白质数据库中进行检索。结果共分离鉴定到8个与贝氏克柯斯体感染相关的蛋白质。这些蛋白主要位于细胞质中，其功能涉及核酸合成，细胞骨架结构，RNA的代谢和转运，细胞周期调控以及细胞防御等。结论上述发现为研究宿主细胞与贝氏克柯斯体相互作用提供了新线索。     

贝氏考克斯体毒力与毒力相关蛋白芯片的研制

目的:构建贝氏考克斯体毒力与毒力相关蛋白芯片.方法:根据贝氏考克斯体全基因组序列,筛选出约160个编码毒力及毒力相关蛋白的基因,采用PCR扩增基因片段,将获得的基因片段与pET32a表达载体连接,然后将该重组质粒转化大肠杆菌并使目的基因表达,采用Ni-NTA亲和层析柱纯化表达的目的重组蛋白.将纯化的重组蛋白点在醛基化玻片上制备蛋白芯片.结果:由贝氏考克斯体104个重组蛋白构建毒力与毒力相关蛋白芯片,通过荧光扫描仪分析蛋白芯片与贝氏考克斯体感染的小鼠血清反应,发现10个重组蛋白与该血清反应为强阳性.结论:所制备的毒力与毒力相关蛋白芯片具有贝氏考克斯体特异性,可用于贝氏考克斯体感染患者血清的检测.     

实时荧光定量PCR检测普氏立克次体

目的 采用新型TaqMan—MGB探针建立检测普氏立克次体的实时荧光定量PCR方法。方法 根据普氏立克次体外膜蛋白B的基因（ompB）序列设计引物和探针，以克隆的ompB基因片段作DNA模板，在荧光定量PCR检测仪（ABI7900型）上建立实时荧光定量检测方法。结果 建立的定量标准曲线的循环阈值（Q）与模板拷贝数呈良好的线性关系（r=0．999）；与巢式PCR相比较，荧光定量PCR检测敏感性是其100倍。用荧光定量PCR检测莫氏立克次体及其他相关立克次体和细菌DNA，检出结果均为阴性。用荧光定量PCR检测普氏立克次体感染的豚鼠血标本，某些样本检测为阳性，而用巢式PCR检测的结果均为阴性。结论 研究中建立的检测普氏立克次体实时荧光定量PCR具有很高的特异性和敏感性，适合于快速检测样本中微量普氏立克次体DNA，可用作临床实验室快速确诊流行性斑疹伤寒。     

用单克隆抗体作Q热立克次体保护性抗原的分析

从研制成功的Ⅰ相及Ⅱ相Q热立克次体单克隆抗体(McAbⅠ及McAbⅡ)中,选择1-4B_5(Ⅰ相)及2-2E_5(Ⅱ相)单抗作中和试验和被动保护试验证明,McAbⅠ具有明显的抗Q热立克次体感染的作用。1-4B_5与10~3MID_(50)纯化活立克次体在体外作用后,接种BALB/c小鼠能完全保护小鼠不发生感染。在小鼠腹腔接种10~3MID_(50)Q热立克次体前一小时及以后隔日     

北亚立克次体单克隆抗体的产生及用于我国斑点热立克次体的鉴定

本文报道以斑点热立克次体精河株全细胞抗原免疫BALB/c小鼠,取10~8免疫小鼠脾细胞与10~7 Sp 2/0小鼠骨髓瘤细胞用50％PEG 1000融合,以微量间接免疫荧光(Micro-IFA)检测抗体。本试验融合率为79.2％,抗体分泌阳性率为22.7％。选择抗体滴度较高的三孔进行扩大培养及克隆化,选出三株杂交瘤细胞1—2C_(12),1—2F_5和1—2C_5,其腹水单克隆抗体