丙型肝炎病毒与PKR信号转导系统

0引言在病毒感染真核细胞的过程中,干扰素(IFN)诱导细胞的抗病毒机制是机体防御感染的第一道防线.在病毒感染过程中,分泌的干扰素主要用于保护邻近细胞免受感染,限制病毒扩散.Ⅰ型IFN由IFN-α、IFN-β两种亚型组成,IFN-α主要由白细胞分泌产生,IFN-β     

精氨琥珀酸裂解酶上调乙型肝炎病毒表面抗原启动子Ⅰ的研究

目的了解精氨琥珀酸裂解酶(ASL)与乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原启动子-Ⅰ(SpⅠ)的关系，研究精氨琥珀酸裂解酶与SPⅠ在HBV致病的分子生物学机制中的作用。方法应用聚合酶链反应(PCR)扩增精氨琥珀酸裂解酶编码基因。以T-A克隆法，将ASL基因片段连人载体pGEM—T。将获得的质粒pGEM-T-ASL，与报告质粒pcDNA3．1(-)分别用KpnⅠ和XhoⅠ双酶切后构建ASL表达载体pcDNA3．1(-)-ASL，将重组表达载体pcDNA3．1(-)-ASL和pCAT3-SpⅠ瞬时转染HepG2细胞，同时转染pCAT3-basic入HepG2细胞，作为阴性对照，48h后收获细胞。用酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞中报告基因氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性，以了解ASL对SpⅠ转录活性的调节作用。结果构建的真核表达载体pcDNA3．1(-)-ASL经过酶切鉴定和测序证实正确。在真核表达载体pcDNA3．1(-)-ASL和pCAT3-SpⅠ共转染的HepG2细胞中，CAT表达活性是CAT3空载体的3．3倍，是pCAT3-SpⅠ的1．45倍。结论精氨琥珀酸裂解酶可以上调SpⅠ启动子的活性，促进表面抗原基因的表达。     

乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活基因5的筛选克隆与重组蛋白诱导表达

目的 克隆人类乙型肝炎病毒(HBV)前-S1蛋白(pre-S1)反式激活新型靶基因PS1TP5.构建其原核表达载体,并诱导其在大肠埃希菌中表达.方法 以HBV前-S1表达质粒pcDNA3.1(-)-preS1转染HepG2细胞,空载体pcDNA3.1(-)作为平行对照,提取mRNA进行抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization, SSH)技术分析,结合生物信息学(bioinformatics)技术筛选得到人类新基因PS1TP5.应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,以提取的HepG2细胞mRNA为模板,扩增获得PS1TP5基因片段,选用pGEM-T载体进行TA克隆,通过PCR、限制性酶切分析及测序进行鉴定,再将其亚克隆到原核表达载体pET-32a( )中,转化进BL21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导获得了PS1TP5重组蛋白的表达,表达产物进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)分析,考马斯亮蓝染色,以抗-His的单克隆抗体进行Western blotting免疫印迹分析证实表达蛋白的特异性.结果 成功扩增出PS1TP5基因.并将其插入pET-32a( )原核表达载体,经BL21(DE3)受体菌转化、IPTG诱导、SDS-PAGE分析获得了PS1TP5重组蛋白的表达,Western blotting证实了重组蛋白表达的特异性.结论 应用SSH、RT-PCR与生物信息学技术筛选克隆出PS1TP5基因,构建了pET-32a( )-PS1TP5原核表达载体,并利用大肠埃希菌原核表达系统成功获得了pET-32a( )-PS1TP5重组蛋白的表达.为进一步研究PS1TP5免疫原性及慢性乙型肝炎发病机制创造了条件.     

丙型肝炎病毒包膜蛋白E2抗原模拟表位的筛选和鉴定

目的：筛选丙肝病毒（HCV）包膜蛋白（E2）特异性噬菌体模拟表位。方法：以抗－HCV E2的单克隆抗体作为固相筛选分子，对噬菌体同七肽库进行5轮“吸附－洗脱－扩增“的筛选过程，随机挑取50个克隆，经酶联免疫吸附法（ELISA）鉴定、交叉反应以及竞争抑制性实验，最后对所选克隆进行DNA序列分析，以确定HCV E2抗原的模拟表位。结果：经噬菌体富集后，得到12个阳性克隆，确定氨基酸序列XXPXYXW为HCV E2的模拟表位。结论：用噬菌体七肽库成功筛选得到HCV E2的模拟表位，为开展用HCV模拟表位探索HCV的防治研究创造了条件。     

筛选与克隆丙型肝炎病毒NS5A蛋白结合蛋白的基因

细胞内蛋白－蛋白的结合是丙型肝炎病毒（HCV）与宿主肝细胞相互作用的分子生物学基础。HCV的非结构蛋白5A（NS5A）被认为是一种HCV基因组编码的重要调节蛋白因子，参与HCV的复制、转录和信号传导等过程，但是它在HCV的致病及耐药等方面的作用还存有争议。为了进一步阐明这个多功能蛋白质与宿主蛋白的关系，作者采用酵母双杂交系统3，在酵母细胞融合蛋白表达型人肝cDNA文库中进行筛选，得到35个与NS5A特异性结合的阳性克隆，包括载脂蛋白、线粒体单体型基因，磷脂酸酸性磷酸酶等11种已知功能蛋白质基因和3个未知功能基因。本研究结果为阐明NS5A在HCV致病中的作用提供了重要研究线索。     

乙型肝炎病毒基因组准种与变异特点的研究

探讨乙型肝炎病毒（HBV）基因组异质性及其生物学意义。以已知HBV基因序列为依据，设计特异性多聚酶链反应（PCR）引物，自2例慢性HBV感染患者外周血血清中扩增HBV基因组序列，克隆入pGEM Teasy质粒，随机挑选克隆进行DNA测序并加以比较。测序结果发现，来源不同的5株HBV全基因组核苷酸序列的一致率为93．6％，不同克隆的4个开放读码框架长度有明显区别，氨基酸序列中存有移框、缺失、替换等多种变异类型。说明来源于同一患者的HBV基因组序列之间存在有较明显的变异现象，在患者体内构成了准种群。     

乙型肝炎病毒序列准种个体化特征的研究

以乙型肝炎病毒（HBV）多聚酶（P）逆转录酶（RT）区及表面抗原（HBsAg)主蛋白、e抗原（HBeAg)氨基酸序列异质性来探讨HBV准种群在感染个体中的变异特点。应用多聚酶链反应（PCR）方法自8例慢性HBV患者血清中扩增靶基因，克隆入T载体，随机挑选27株克隆测序，将获得基因的推断氨基酸序列进行比较后发现：病毒结构／非结构蛋白氨基酸序列存在广泛的变异现象，替换突变表现出一定的个体特异性，其结果是导致HBV在特定的患者体内可能存在特征性的变异。本研究提示HBV在患者体内的蛋白序列多样性是乙型肝炎慢性化的一个重要原因。     

丙型肝炎病毒转基因小鼠模型的研究

0引言丙型肝炎病毒(HCV)是1989年美国Chooetal[1]利用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术分离鉴定的一种新型肝炎病毒,属黄病毒科丙型肝炎病毒属.其基因组为单股正链RNA,长9.4kb左右,两侧分别为5’和3’非编码区(NCR),中间为单一的开放读码框(ORF),可分为核壳蛋白区(C区)、包膜蛋白区(E区)和非结构蛋白区(NS区).其中,5’NCR区变异较小,内含内部核糖体进入位点(IRES),在病毒蛋白的翻译中有重要的调控功能.C区与E1/E2区构成结构基因,分别编码衣壳蛋白和包膜糖蛋白,内含重要的中和抗原表位与细胞免疫抗原表位,与HCV的免疫致病及防…