筛选转化生长因子β1刺激肝星状细胞差异表达基因的研究

目的 筛选转化生长因子β 1(TGF β 1)刺激大鼠肝星状细胞(Hsc)的差异表达基因,以揭示TGF β1介导肝纤维化的分子发病机制. 方法分别用Trizol法抽提TGF β1刺激的HSC及磷酸盐缓冲液刺激为对照的HSC总RNA,逆转录合成双链cDNA,制备掺入生物素标记的cDNA探针,与人基因表达谱芯片杂交,用Agilent扫描仪对芯片结果进行扫描,利用软件对差异表达基因进行生物信息学分析. 结果 从13824条目的 基因中筛选出177条差异表达基因,其中123条基因表达上调,其中包括:结缔组织生长因子,微管蛋白ε 1,V型胶原α2,连环蛋白6 2,钙粘蛋白6,2型,Smad3,丝裂源活化蛋白激酶4,生长因子受体结合蛋白7,丝裂原活化蛋白激酶相互作用/丝氨酸/苏氨酸激酶1等;54条基因表达下调,包括:肿瘤坏死因子受体相关因子4,干扰素调节因子7,干扰素诱生蛋白p78,骨形态发生蛋白7,基质gLa蛋白,人类丝氨酸蛋白酶抑制剂进化支B成员8,干扰素刺激基因2.0×104,死亡相关蛋白6,金属硫蛋白1H,超氧化物歧化酶2等;同时筛选到8个未知功能蛋白. 结论 应用基因表达谱芯片技术成功筛选了TGF β 1刺激HSC的差异表达基因,初步揭示了TGF β1致肝纤维化的分子机制是诸多因素共同作用的结果,为进一步寻找新的基因治疗靶点奠定了基础.     

应用抑制性消减杂交技术筛选血小板衍生生长因子上调的大鼠肝星状细胞靶基因

目的应用抑制性消减杂交（SSH）技术构建血小板衍生生长因子（PDGF）-BB刺激的大鼠HSC上调基因的cDNA消减文库,从分子生物学角度阐明PDGF在肝纤维化中的作用机制。方法以PDGF-BB刺激的HSC作为实验组,以未用PDGF-BB刺激的HSC作为对照组,分别收获细胞提取总mRNA,并逆转录为cDNA。经RsaⅠ酶切后将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性PCR扩增。将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转化大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆经PCR扩增后进行测序及生物信息学分析。结果成功构建了PDGF-BB刺激HSC差异表达基因的cDNA消减文库。文库扩增后得到102个阳性克隆,经菌落PCR分析,得到93个200～1000 bp的插入片段。挑取含有插入片段的31个克隆进行测序,通过生物信息学分析获得13种已知基因序列,主要包括电压依赖性阴离子通道、热休克蛋白质47、Ras家族基因RAN等蛋白质基因。结论PDGF- BB作为最有效的促有丝分裂原在激活HSC过程中上调某些与细胞生长相关的蛋白质、参与细胞内代谢的蛋白质及分子伴侣蛋白质等基因的表达,这将为进一步阐明PDGF-BB刺激HSC介导肝纤维化的分子生物学机制提供理论依据。     

乙型和丙型肝炎病毒对细胞周期素及细胞周期素依赖性蛋白激酶的调节

0 引言乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)感染与肝细胞癌(HCC)发生发展之间的密切关系,早已被大量的临床医学和临床流行病学资料所证实。随着细胞周期(cell cycle)调节的分子生物学机制研究不断深入,特别是关于细胞周期素(cyclin)、细胞周期素依赖性激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)的发现,使得细胞周     

丙型肝炎病毒与PKR信号转导系统

0引言在病毒感染真核细胞的过程中,干扰素(IFN)诱导细胞的抗病毒机制是机体防御感染的第一道防线.在病毒感染过程中,分泌的干扰素主要用于保护邻近细胞免受感染,限制病毒扩散.Ⅰ型IFN由IFN-α、IFN-β两种亚型组成,IFN-α主要由白细胞分泌产生,IFN-β     

精氨琥珀酸裂解酶上调乙型肝炎病毒表面抗原启动子Ⅰ的研究

目的了解精氨琥珀酸裂解酶(ASL)与乙型肝炎病毒(HBV)表面抗原启动子-Ⅰ(SpⅠ)的关系，研究精氨琥珀酸裂解酶与SPⅠ在HBV致病的分子生物学机制中的作用。方法应用聚合酶链反应(PCR)扩增精氨琥珀酸裂解酶编码基因。以T-A克隆法，将ASL基因片段连人载体pGEM—T。将获得的质粒pGEM-T-ASL，与报告质粒pcDNA3．1(-)分别用KpnⅠ和XhoⅠ双酶切后构建ASL表达载体pcDNA3．1(-)-ASL，将重组表达载体pcDNA3．1(-)-ASL和pCAT3-SpⅠ瞬时转染HepG2细胞，同时转染pCAT3-basic入HepG2细胞，作为阴性对照，48h后收获细胞。用酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞中报告基因氯霉素乙酰转移酶(CAT)的表达活性，以了解ASL对SpⅠ转录活性的调节作用。结果构建的真核表达载体pcDNA3．1(-)-ASL经过酶切鉴定和测序证实正确。在真核表达载体pcDNA3．1(-)-ASL和pCAT3-SpⅠ共转染的HepG2细胞中，CAT表达活性是CAT3空载体的3．3倍，是pCAT3-SpⅠ的1．45倍。结论精氨琥珀酸裂解酶可以上调SpⅠ启动子的活性，促进表面抗原基因的表达。     

乙型肝炎病毒前-S1蛋白反式激活基因5的筛选克隆与重组蛋白诱导表达

目的 克隆人类乙型肝炎病毒(HBV)前-S1蛋白(pre-S1)反式激活新型靶基因PS1TP5.构建其原核表达载体,并诱导其在大肠埃希菌中表达.方法 以HBV前-S1表达质粒pcDNA3.1(-)-preS1转染HepG2细胞,空载体pcDNA3.1(-)作为平行对照,提取mRNA进行抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization, SSH)技术分析,结合生物信息学(bioinformatics)技术筛选得到人类新基因PS1TP5.应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术,以提取的HepG2细胞mRNA为模板,扩增获得PS1TP5基因片段,选用pGEM-T载体进行TA克隆,通过PCR、限制性酶切分析及测序进行鉴定,再将其亚克隆到原核表达载体pET-32a( )中,转化进BL21(DE3)宿主菌,经IPTG诱导获得了PS1TP5重组蛋白的表达,表达产物进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)分析,考马斯亮蓝染色,以抗-His的单克隆抗体进行Western blotting免疫印迹分析证实表达蛋白的特异性.结果 成功扩增出PS1TP5基因.并将其插入pET-32a( )原核表达载体,经BL21(DE3)受体菌转化、IPTG诱导、SDS-PAGE分析获得了PS1TP5重组蛋白的表达,Western blotting证实了重组蛋白表达的特异性.结论 应用SSH、RT-PCR与生物信息学技术筛选克隆出PS1TP5基因,构建了pET-32a( )-PS1TP5原核表达载体,并利用大肠埃希菌原核表达系统成功获得了pET-32a( )-PS1TP5重组蛋白的表达.为进一步研究PS1TP5免疫原性及慢性乙型肝炎发病机制创造了条件.     

丙型肝炎病毒包膜蛋白E2抗原模拟表位的筛选和鉴定

目的：筛选丙肝病毒（HCV）包膜蛋白（E2）特异性噬菌体模拟表位。方法：以抗－HCV E2的单克隆抗体作为固相筛选分子，对噬菌体同七肽库进行5轮“吸附－洗脱－扩增“的筛选过程，随机挑取50个克隆，经酶联免疫吸附法（ELISA）鉴定、交叉反应以及竞争抑制性实验，最后对所选克隆进行DNA序列分析，以确定HCV E2抗原的模拟表位。结果：经噬菌体富集后，得到12个阳性克隆，确定氨基酸序列XXPXYXW为HCV E2的模拟表位。结论：用噬菌体七肽库成功筛选得到HCV E2的模拟表位，为开展用HCV模拟表位探索HCV的防治研究创造了条件。     

筛选与克隆丙型肝炎病毒NS5A蛋白结合蛋白的基因

细胞内蛋白－蛋白的结合是丙型肝炎病毒（HCV）与宿主肝细胞相互作用的分子生物学基础。HCV的非结构蛋白5A（NS5A）被认为是一种HCV基因组编码的重要调节蛋白因子，参与HCV的复制、转录和信号传导等过程，但是它在HCV的致病及耐药等方面的作用还存有争议。为了进一步阐明这个多功能蛋白质与宿主蛋白的关系，作者采用酵母双杂交系统3，在酵母细胞融合蛋白表达型人肝cDNA文库中进行筛选，得到35个与NS5A特异性结合的阳性克隆，包括载脂蛋白、线粒体单体型基因，磷脂酸酸性磷酸酶等11种已知功能蛋白质基因和3个未知功能基因。本研究结果为阐明NS5A在HCV致病中的作用提供了重要研究线索。