丙型肝炎病毒F蛋白结合蛋白1基因的克隆化与序列分析

目的 对命名为F蛋白结合蛋白1(FBP1)的未知基因,克隆其全长基因并进行生物信息学分析.方法 应用酵母双杂交技术得到FBP1,应用分子生物学技术克隆FBP1的基因编码序列.结果 经酶切和测序鉴定,结果完全正确,成功克隆了FBP1的基因编码序.结论 FBP1通过与F蛋白结合,在病毒蛋白与宿主细胞蛋白相互作用过程中发挥重要作用.     

应用酵母双杂交技术筛选与乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白2结合的肝细胞蛋白编码基因

目的构建乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白2(HBEBP2)的真核表达载体并筛选人肝细胞中与HBEBP2相互作用的基因。方法通过PCR扩增获得HBEBP2基因,构建真核表达载体pGBKT7-HBEBP2,转化酵母菌AH109并在其中进行表达。随后与预转化了人肝细胞文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)和铺有X-α-gal的营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)上进行双重筛选获得阳性克隆。提取文库质粒pACT2-DNA并与pGBKT7-HBEBP2共同转化AH109酵母菌株,于铺有X-α-gal的营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)上进行筛选以排除假阳性克隆。挑取真阳性克隆送测序,并进行生物信息学分析。结果筛选出6种与HBEBP2相互作用的蛋白,其中包括人类线粒体蛋白、人类α-2-糖蛋白1、人类磷酸甘露糖-p-长醇利用缺陷1和人类丝氨酸蛋白酶抑制剂等4个已知功能蛋白及2个未知功能序列。结论筛出人肝细胞中一组与HBEBP2相互作用的蛋白,为进一步探讨HBEBP2在HBV致病过程中的作用奠定了基础。     

MHBst167基因转染对肾小管上皮细胞膜结合型补体调节蛋白表达的影响

补体激活导致肾组织免疫损伤是肾脏疾病的重要发病机制，而肾脏固有细胞可表达一系列补体调节蛋白对其激活进行限制。肾脏是乙型肝炎病毒（HBV）感染的主要靶脏器之一，其中肾小管上皮细胞尤易被感染。病毒感染与宿主细胞应答间的关系极为复杂，HBV-DNA与宿主DNA整合的过程中可发生基因重排，编码HBx、LHBs和MHBs^1等反式激活因子，进而活化多种转录因子和原癌基因启动子，参与感染后的炎性反应。以往研究表明乙型肝炎病毒相关性肾炎（HBV-GN）患者肾小管上皮细胞中可检测到HBV—DNA，并且大多为整合型。     

应用酵母双杂交技术筛选和克隆视黄醇脱氢酶11结合蛋白基因

视黄醇脱氢酶11（RDH11）广泛存在于视网膜、心脏、肝脏、胰腺、脑、睾丸和肾脏组织，在前列腺高水平表达，与前列腺癌的发生、发展密切相关。在以HCV核心蛋白作为诱饵对肝细胞cDNA文库进行筛选的研究中，我们发现一个能与核心蛋白结合且功能未知的新基因，命名为HCV核心蛋白结合蛋白12（HCBP12），后来证明其为RDH11。慢性丙型肝炎也是一种代谢性疾病，代谢异常是HCV慢性感染发病机制的重要组成部分。HCV核心蛋白可以与RDH11结合，可能通过改变其酶学催化作用导致肝脏正常代谢途径的紊乱。我们构建了RDH11的真核表达载体，应用酵母双杂交技术筛选RDH11蛋白在肝细胞中相互作用的蛋白，并对筛选出的新基因进行了克隆化。     

羧基末端截短型乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白反式激活作用的研究

0 引言乙型肝炎病毒(HBV)的感染,不仅引起急、慢性病毒性肝炎,而且与肝纤维化、肝细胞癌的发生、发展过程密切相关。病毒进入到肝细胞之后,肝炎病毒蛋白在肝细胞内不是孤立存在的,病毒基因组在肝细胞     

HCV p7蛋白反式调节基因p7TP2的克隆化及生物信息学分析

目的:克隆HCV p7蛋白反式调节未知功能新基因p7TP2,构建其真核表达载体,并应用生物信息学初步探讨其结构及功能．方法:应用PCR技术从HepG2细胞提取的 cDNA扩增p7TP2基因,选用pGEM-T载体进行TA克隆,通过PCR,限制性酶切分析及测序进行鉴定,再将其亚克隆到真核表达载体 pcDNATM3．1／myc-His A,通过PCR,限制酶切分析进行鉴定,并应用生物信息学初步分析其物理化学性质、蛋白质结构域、功能及染色体定位．结果:成功从HepG2细胞提取的cDNA中扩增出p7TP2基因,编码区为495核苷酸(nt),编码产物为164氨基酸残基(aa),经核苷酸序列数据库(GenBank)同源序列的搜寻,与已知基因序列和蛋白序列之间没有显著同源性,属于未知功能新基因,并成功进行TA克隆,酶切、测序均正确,并进一步亚克隆至pcDNATM3．1／ myc-His A真核表达载体,生物信息学分析此基因位于8q24．3,Mr17 146．5,理论pI:9．26,半衰期为30 h(体外哺乳类网状细胞),属于不稳定蛋白,疏水指数较高,含有潜在的三个螺旋区域,四个β折叠,四个蛋白激酶C磷酸化位点, 一个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,5个N-肉豆蔻酰位点,预测可能为具有不紧密的球蛋白结构,具有信号肽及两个跨膜结构域．结论:发现了HCV p7反式调节新的靶基因, 构建了pcDNATM3．1／myc-HisA真核表达载体．     

转化生长因子β_1刺激肝星状细胞差异表达下调基因筛选

目的筛选并克隆转化生长因子β1(TGF-β1)刺激肝星状细胞差异表达下调基因,阐明TGF-β1导致肝纤维化的分子生物学机制。方法以TGF-β1及磷酸盐缓冲液分别刺激大鼠肝星状细胞(即实验组和对照组),提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将对照组细胞cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与实验组细胞cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性PCR扩增,将产物与pGEM-Teasy载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠埃希菌进行文库扩增,随机挑选克隆经PCR扩增后进行测序及同源性分析。结果成功构建了TGF-β1刺激肝星状细胞差异表达基因的cDNA消减文库。文库扩增后得到98个阳性克隆,进行菌落PCR分析,均得到200～1000bp插入片段。选取含有插入片段的35个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得了19种已知基因序列和2个未知功能基因。结论应用抑制性消减杂交技术成功构建了TGF-β1刺激的肝星状细胞差异表达基因的cDNA消减文库,为进一步阐明TGF-β1参与肝纤维化的分子生物学机制提供了理论依据。     

转化生长因子β1活化肝星状细胞反式激活新基因剪切体的功能

目的 探讨反式激活新基因剪切体TTG 1 A的生物学功能和参与肝纤维化的致病机制.方法 应用酵母双杂交系统3,将PCR扩增的TTG1A基因与酵母表达载体pGBKT7连接,转化酵母细胞AH109,并在其内表达,而后与转化了人白细胞文库的质粒pACT2的单倍体酵母细胞Y187进行配合,在涂有X-α-gal营养缺陷型培养基上进行双重筛选,提取阳性酵母克隆的质粒转化大肠杆菌经Bgl Ⅱ酶切后测序,进行生物信息学分析. 结果成功构建了重组酵母表达载体pGBKT7-TTGlA.应用酵母双杂交系统3从人白细胞文库中筛选出19个与TTGlA相互作用的蛋白,其中包括人类主要组织相容性复合物Ⅱ型DP D(HLA-DP β),人类核糖体蛋白L30、人类核磷蛋白B23、人类核组蛋白2、人类ash2、人类变异的家族性睥性贫血和变异的异染性脑白质营养不良相关蛋白,人类死亡因子4(MORF4L1)、人类遍在蛋白偶连酶E2L3、人类载脂蛋白A-1(APOA1)、人类半乳凝素1以及5个未知功能蛋白. 结论 成功构建了重组酵母表达载体pGBKT7-TTGlA,初步揭示了新基因TTGlA的生物学功能,为进一步研究TGF β1介导的肝纤维化分子发病机制中的作用提供基础.     

超声诊断腹外疝的临床价值

腹外疝是外科常见病之一．超声检查腹外疝为临床提供非常实用的诊断方法。对本院2000年3月至2008年7月经手术证实的107例腹外疝患者超声检查结果进行回顾性分析，旨在评价高频超声在腹外疝诊断中的应用价值，并探讨不同类型腹外疝的临床病理类型及其声像图特点。     

HCV核心蛋白结合蛋白基因6的克隆

目的：克隆与丙型肝炎病毒（HCV）核心蛋白结合的肝细胞中的未知蛋白基因。方法：应用酶母双杂交系统，构建丙型肝炎病毒核心蛋白诱铒质粒，转化酵母AH109后与含文库质粒的酵母Y187进行配合，在营养缺陷培养基上进行双杂交筛选。筛选出30个克隆，既能在四缺营养缺陷培养基上生长(SD/Trp-Leu-Ade-His）又能在涂有x-α-gal的四缺培养平皿上长出蓝色菌落，提取此酵母克隆的质粒，转化大肠埃希菌后进行测序，进行生物信息学分析。结果：分析结果显示，其中6号克隆的测序结果与Genbank中的2个未知功能序列有98％的同源性，初步证明了此基因与丙型肝炎病毒核心蛋白有结合性。结论：丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白肝基因克隆成功。