绥中县犬种布氏菌的调查报告

1988年7月至1989年10月,在辽宁省绥中县11个乡(镇)15个村屯对192只家犬进行了布氏菌血清学调查,发现阳性犬18只,对其中15只犬做了B.Canis分离,检出7株,首次发现在绥中县有B.canis存在。     

丙型肝炎病毒E2蛋白结合蛋白E2-BP3剪切体的基因克隆及生物信息学分析

HCV感染致肝细胞损伤的机制，很大程度上与病毒蛋白和肝细胞蛋白间的相互作用有关。因此，研究HCV各抗原成分与肝细胞内蛋白的相互作用及其机制能在一定程度上解释HCV的致病机制，为寻找有效防治HCV的方法提供新线索。HCV基因组含有1个长的开放阅读框架（ORF），编码一个约3010个氨基酸残基组成的多蛋白，它被细胞和病毒蛋白酶切至少产生10个病毒产物：核心蛋白（core）、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B蛋白等。HCV包膜蛋白E2的生物学特性与HCV感染的慢性化和抗病毒免疫关系极为密切。张健等采用酵母双杂交系统，在酵母细胞融合蛋白表达型人肝cDNA文库中进行筛选，得到76个与E2特异性结合的阳性克隆，包括人类肝细胞癌相关抗原、硒结合蛋白、核苷传送系统、果糖磷酸激酶等26种已知的功能蛋白基因和14个未知的功能基因，包括E2-BP3基因，为揭示E2潜在的生物学功能提供依据。为进一步探讨未知的功能新基因E2-BP3的生物学功能及其作用，我们对该基因或其剪接体进行分子克隆，期望对其生物学功能进行预测分析，为今后更广泛深入地研究新基因的生物学功能打下基础，并为研究HCV E2的调节作用、丙型肝炎发病机制创造条件。     

乙型肝炎病毒前S1蛋白反式调节基因2的克隆、表达及功能

目的 应用原核表达系统表达HBV前S1蛋白反式调节基因2(PS1TP2),酵母双杂交技术筛选白细胞文库中与之结合的蛋白质,了解该基因产物在肝癌细胞系中的亚细胞定位.方法 应用生物信息学初步探讨PS1TP2结构及功能.PCR扩增PS1TP2基因,构建pET32a(+)-PS1TP2表达载体,在大肠埃希菌Rosettap中进行诱导表达.构建pGBKT7-PS1TP2重组载体,应用酵母双杂交技术,在营养缺陷型培养基上筛选白细胞cDNA文库中与之结合的蛋白质.构建pEGFP-C1-PS1TP2表达质粒,转染肝癌细胞株HepG2,利用荧光显微镜和共聚焦显微镜观察PS1TP2的亚细胞分布.结果 PS1TP2基因位于6q24.1,疏水指数较高.PS1TP2能在原核系统中表达,表达产物相对分子质量约4.1×104.酵母双杂交技术筛选出白细胞cDNA文库中与之结合的蛋白质26个.PS1TP2亚细胞定位于细胞质中.结论 在原核表达系统中成功表达了PS1TP2,为抗体的制备奠定了基础.PS1TP2可与白细胞表达的某些蛋白质相互作用,在肝癌细胞系中定位于细胞质,为进一步探究HBV感染的发病机制提供了新线索.     

HCV NS5A反式激活基因NS5ATP13对肝癌细胞生长的影响

目的验证HCV NS5A对NS5ATP13基因反式激活作用,并检测NS5ATP13基因表达产物对Huh-7细胞系生长的影响。方法应用实时定量逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）方法验证HCV NS5A对NS5ATP13基因的反式激活作用,构建NS5ATP13与绿色荧光蛋白（GFP）的融合蛋白表达载体,用荧光显微镜观察NS5ATP13-GFP融合蛋白在细胞的分布。结果 HCV NS5A可反式激活NS5ATP13基因的表达,NS5ATP13-GFP融合蛋白荧光主要集中在细胞核质,转染细胞出现大量双核及多核现象,活细胞发光法检测NS5ATP13具有促进细胞增殖的作用。结论 NS5ATP13基因生物学功能的研究,为HCV致肝纤维化和肝癌的病理机制研究提供新的思路。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5抗独特型人源单链可变区抗体的筛选与鉴定

目的：制备丙型肝炎病毒（HCV）非结构蛋白NSS（NS5）的抗独特型单链可变区抗体scFv(抗－Id scFv)，为研制HCV NS5的抗－Id scFv疫苗奠定基础。方法：采用噬菌体表面展示技术，将HCV NS5单克隆抗体固相包被于Nunc板，从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮“吸附－洗脱－扩增”筛选过程，随机挑选80个克隆，利用酶联免疫吸附试验（ELISA）、交叉反应和竞争抑制实验，对其进行免疫学检测，获得与HCV NS5单克隆抗体结合活性较强的抗－Id scFv阳性克隆，并对HCV NS5特异性抗－Id scFv的编码序列进行序列测定分析。结果：筛选得到的HCV NS5抗－Id scFv片段由786bp组成，具有结合HCV NS5单克隆抗体的生物学活性和特异性。结论：用噬菌体抗体库技术能够成功地获得HCV NS5的抗－Id scFv。本实验结果为开展用抗－Id scFv防治丙型肝炎的研究创造了条件。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4A抗原模拟表位的筛选和鉴定

目的：筛选丙型肝炎病毒（hepatitis C virus,HCV)非结构蛋白NS4A（HCV NS4A)特异性噬菌体模拟表位，为抗HCV的疫苗研究探索新途径。方法：以抗HCV NS4A的单克隆抗体作为固相筛选分子，对人工合成的噬菌体随机12肽库进行5轮“吸附－洗脱－扩增”的筛选过程，随机挑取45个克隆，经噬菌体酶联免疫吸附法（ELISA）鉴定并进行交叉反应实验以及竞争抑制性结合实验，最后对所选克隆进行DNA序列分析，以确定HCV NS4A抗原的模拟表位。结果：经噬菌体富集后，从随机筛选的45个克隆中得到13个阳性克隆，确定氨基酸序列XXRXXMXPXXXI为HCV NS4A的模拟表位。结论：用噬菌体12肽库成功筛选得到HCV NS4A的模拟表位，为开展用HCV模拟表位探索HCV的防治研究创造了条件。     

乙型肝炎病毒前C/C基因准种与变异特点的研究

以乙型肝炎病毒（HBV）前C／C基因异质性来探讨在慢性感染者体内是否存在HBV准种。以中国株HBV基因序列为依据，设计特异性多聚酶链反应（PCR）引物，自4例慢性HBV感染患者血清中扩增HBV前C／C基因序列，克隆入pGEM Teasy载体，每例患者挑选5个克隆测序以比较病毒的变异程度。测序结果发现同一患者前C／C基因碱基序列之间的同源性大于98％，但存有G83→A替换、C抗原内部缺失、移框突变等多种变异类型。结果提示，HBV长期携带者体内有HBV准种共存，推测前C／C区的多种变异可能与感染慢性化有关。