造血干细胞低温保存与复温操作规程（讨论稿）

The efficacy of cryopreservation of hematopoietic stem cells was influenced by a lot of factors, such as temperature, cooling rate, cell concentration, cryopreservative, thawing procedure, preserved period and measurement of cell functionalities. There were some differences in technology and methodology between research centers in the world, so the results from their publications could be poorly compared with each other and had a weak potency in evidence based medicine. Except for the established protocol for cryostorage of mobilized peripheral blood （MPB） hematopoietic stem cells/hematopoietic progenitor cells （HSC/HPC） and bone marrow （BM） HSC/HPC in Joint Accreditation Committee of International Stem Cell Transplantation （ISCT） Europe and European Bone Marrow Transplantation （EBMT) （JACIE） guidelines, there was no guideline in China and the world. With the help of our experiences (for many years in cryomedical field) and related literatures we have drawn up this protocol for cryopreservation and thawing of hematopoietic stem cells suited for petty bank in hospital. Any comments or revisions will be welcome.     

自体输血脾切除治疗伴重度自身免疫性溶血性贫血的脾淋巴瘤患者1例

目的探讨伴有重度自身免疫性溶血性贫血和巨脾的脾淋巴瘤患者的治疗方法。方法先给予激素治疗提升血红蛋白,而后在自体输血保障下行脾切除术,术后给予干扰素维持治疗。结果患者溶血症状完全缓解,随访2年疾病无进展。结论脾切除术为伴有血细胞减少和巨脾的脾淋巴瘤患者有效治疗手段,自身免疫性溶血贫血患者在病情缓解时开展自体输血具有安全有效的临床意义。     

急性早幼粒细胞白血病患者诱导治疗中出现分化综合征的多因素分析

目的：分析初诊的急性早幼粒细胞白血病（APL）患者在接受全反式维A酸（ATRA）诱导治疗期间出现分化综合征（DS）影响因素。方法收集2005至2014年间海军总医院血液科初诊APL并接受ATRA联合三氧化二砷（ATO）酸或蒽环类药物诱导治疗的84例患者。根据Frankel描述诊断其中35例出现DS。按照潜在危险因素收集数据,对影响DS发生、发展的危险因素进行单因素分析及logistic多因素回归分析。结果 logistic多因素回归分析显示,患者初诊时白细胞计数及早幼粒细胞白血病-维A酸受体α（PML-RARa）基因分型是影响DS发生的独立危险因素（P＜0.05）。进一步对不同组间外周血白细胞计数及PML-RARa基因分型行χ2检验分析,以排除多因素间相互影响因素,结果显示患者初诊时外周血白细胞及PML-RARa基因分型,两组间差异分析存在统计学意义（P＜0.05）。并对PML-RARa基因分型的长（L）亚型及短（S）亚型行χ^2检验分析,结果显示L亚型早幼粒细胞白血病-α纸A酸变体（PML-RARa）基因对DS的发生有统计学意义（P＜0.05）。结论初诊时外周血白细胞计数较高的患者及PML-RARa基因为L亚型的患者在初期接受维A酸联合诱导化疗时更易出现DS。     

粟粒性结核误诊为红白血病1例

1986年2月我院收治了一例发热伴全血象减低的病人,当时临床诊断为红白血病.死后尸解证实为急性粟粒性结核.现报道如下.患者男,29岁,已婚,干部.病案号:157106.因畏寒、发热、鼻衄、牙龈出血17天于1986年2月7日入院.患者于1986年1月20日劳累后感咽干、流涕、畏寒、发热,体     

华通胶间充质干细胞低温保存后生物学特性研究

本研究旨在探讨低温保存对华通胶间充质干细胞（wJ-MSC）生物学特性的影响,为低温保存后WJ-MSC的临床应用及建立WJ-MSC库提供实验依据。通过脐带组织块培养制备WJ-MSC,将第5代WJ-MSC加入低温保护剂,-80℃冰箱降温,液氮保存。细胞复温后行培养和传代,低温保存组第1代（PP1）传代获得PP2-PP15。非低温保存组第6代为对照组第1代（CP1）,传代获得CP2-CP15。比较对照组与低温保存组WJ-MSC的有核细胞回收率、台盼蓝拒染率、CCK-8活性、凋亡率、贴壁率、增殖指数、细胞表面抗原、细胞周期和向脂肪细胞、成骨细胞及神经元细胞诱导分化能力。结果表明,WJ-MSC经低温保存,有核细胞回收率为98．2％,台盼蓝拒染率为94．3％,CCK-8活性为91．4％,凋亡率为3．9％,贴壁率为92．6％;PP1较CP1增殖指数明显降低（P〈0．05）,PP2-PP15与相应对照组增殖指数的差异均无统计学显著性;WJ-MSC高表达CD29、CD90、CD44、CD71、CD73、CDl05、CDl66和HLA-ABC,低表达CD34、CD45和HLA-DR,两组之间差异均无统计学显著性;增殖潜伏期和对数增殖期两组之间差异也无统计学意义;向脂肪细胞、成骨细胞和神经元细胞诱导分化后分别进行油红0、碱性磷酸酶（ALP）和神经元特异性烯醇化酶（NSE）染色,两组间阳性强度肉眼观察无明显差异;细胞内甘油三酯、ALP和NSE含量两组间也无显著差异。结论：WJ-MSC低温保存后少量细胞（〈10％）受到损伤,传代培养表明其生物学特性基本保持不变。     

抗甲硝唑人源scFv抗体筛选与鉴定

目的 筛选甲硝唑人源单链可变区（scFv）抗体,为研究快速检测试剂盒奠定基础.方法 采用噬菌体表面展示技术,以甲硝唑作为抗原,固相包被于Nunc板,应用半合成的人源单链可变区抗体文库技术,从噬菌体单链可变区抗体库中经过3轮＂吸附-洗脱-扩增＂筛选过程,随机挑选抗甲硝唑的90个克隆,利用酶联免疫吸附法（ELISA）、交叉反应及竞争抑制实验,对其进行免疫学检测和鉴定,获得与甲硝唑结合活性较强的scFv阳性克隆,从噬菌体抗体阳性克隆中提取质粒,经酶切鉴定SfiⅠ/NotⅠ后,亚克隆到pCANTAB5E载体;转化大肠埃希菌XL1-Blue,提取质粒进行酶切鉴定分析.结果 经过筛选90个克隆中有16株克隆ELISA的490 nm波长吸光度（A490nm）值较高,将这些噬菌体上清与牛血清清蛋白（BSA）进行交叉反应,确定有4株交叉反应较弱,结合3次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果,最后确定1株阳性克隆.亚克隆到pCANTAB5E载体;转化大肠埃希菌感受态细胞XL1-Blue.结论 提取质粒酶切片段与目的相符,为下一步研究其特异性亲和力的研究创造了条件.     

来源于骨髓、外周血与脐带血的间充质干细胞生物学特性比较

背景：间充质干细胞存在于人体多种组织,目前研究报道所用细胞来源单一,培养方法差异大,得出的结果不一致,不能证明分离、培养出的细胞是相同的细胞,难以比较。 目的：课题提出在体外培养条件下可对同一个体来源的骨髓、外周血来源间充质干细胞及不同个体脐带血来源间充质干细胞的生物学特性进行比较的理论假设。 设计、时间及地点：细胞学体外对照观察,于2007-06/2008-12在解放军海军总医院血液科完成。 材料：解放军海军总医院血液科造血干细胞移植供者10例,取同一供者的骨髓、外周血细胞,细胞体积分别为20 mL与2 mL。解放军海军总医院产科10例健康初产妇脐带血细胞,细胞体积为30 mL。 方法：采用Percoll密度梯度+贴壁法分离骨髓、外周血、脐带血来源的间充质干细胞,加入含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12培养基。当细胞生长汇合至80%~90%时胰蛋白酶-EDTA消化,制成5×108 L-1细胞悬液,计为P0。重复上述操作,即为P1,依此类推P2~P5。 主要观察指标：细胞生长形态观察,细胞瑞氏-吉姆萨染色结果,细胞化学染色结果,细胞增殖数量,流式细胞仪检测细胞表面标记。 结果：①骨髓间充质干细胞贴壁时间、汇合至50%时间、汇合至80%时间均早于外周血、脐带血间充质干细胞;骨髓间充质干细胞培养5~7 d时呈漩涡状生长,而外周血、脐带血间充质干细胞无此生长特性。②初始培养和传代培养后,骨髓间充质干细胞多为成纤维样细胞,仅有少量内皮样细胞;而传至第5代的外周血、脐带血间充质干细胞除有成纤维样细胞外,还有较多的内皮样细胞和单核-巨噬样细胞。③P1~P5骨髓、外周血及脐带血来源间充质干细胞PAS染色、碱性磷酸酶染色、苏丹黑B染色均呈阴性。④与P0细胞比较,传代培养至P5后骨髓间充质干细胞增殖数量明显多于外周血、脐带血间充质干细胞(P < 0.05)。⑤CD29,CD44,CD90,CD71,CD105,CD166和HLA-ABC阳性率,骨髓间充质干细胞接种后≤6%, P0~P5为55.9%~92.8%;外周血间充质干细胞接种后≤10%,P0~P5为19.7%~33.4%;脐带血间充质干细胞接种后≤20%,P0~P5为35.4%~93.2%。CD34,CD45和HLA-DR阳性率,3种来源的间充质干细胞均极低。CD14,CD31阳性率,骨髓间充质干细胞极低,外周血间充质干细胞为12.1%~28.3%,脐带血间充质干细胞为8.1%~21.3%。 结论：结果显示在体外培养条件下,骨髓、外周血和脐带血均能较好地形成间充质干细胞,以骨髓来源的间充质干细胞含量最高,成分单一,而脐带血和外周血含量次之,细胞成分多。     

造血干细胞低温保存与临床应用

目的观察低温保存造血于细胞（hematopoietic stem cell,HSC）的效率及冻存HSC的临床应用情况。方法25例骨髓造血干细胞（bone marrow stem cell,BMSC）以10％二甲基亚砜加10％自体血浆为冷冻保护剂,采用程控降温液氮保存。21例外周血于细胞（peripheral blood stem cell,PBSC）采用CP1（cryopreservativesl）加4％人血白蛋白为冷冻保护剂,非程控降温后液氮保存或低温冰箱保存。检测复温后单个核细胞（MNC）回收率、粒-单细胞集落形成单位（CFU—GM）回收率、台盼蓝拒染率（TBR）,并行细菌学培养,移植后观察输注反应及植入情况。结果BMSC冻存时间为1～3个月,中位时间1个月。复温后MNC回收率为（97．74±0．85）％,TBR为（96．74±0．91）％,CFU—GM回收率为（72．04±1．87）％。PBSC冻存时间为1～20个月,中位时间2个月。复温后MNC回收率为（97．75±1．34）％,TBR为（96．28±2．16）％。复温后46份标本细菌学培养均为阴性。实施自体骨髓造血干细胞移植（ABMSCT）25例,中性粒细胞绝对值（ANC）〉0．5×10^9／L的时间为（10．79±0．93）d,血小板计数（PLT）〉20×10^9／L的时间为（12．88±0．95）d。实施自体外周血造血干细胞移植（APBSCT）21例,ANC〉0．5×10^9／L的时间为（10±1．14）d,PLT〉20×10^9／L的时间为（12．04±2．13）d。两组间MNC回收率和TBR比较均无显著性差异,移植后APBSCT组ANC〉0．5×10^9／L的时间早于ABMSCT组,有显著性差异（P〈0．05）,但PLT〉20×10^9／L的时间两组无显著差异。出院前所有患者复查骨髓均示增生活跃或明显活跃。BMSC输注出现的不良反应明显多于PBSC输注。结论采用联合冷冻保护剂、非程控降温后液氮保存或低温冰箱保存来冻存HSC是切实可靠的,这种方法操作简便、价格低廉、安全有效;建议今后冻存BMSC前应去除红细胞。     

造血干细胞移植后多发真菌性肺脓肿1例

侵袭性真菌感染(IFI)是造血干细胞移植术后的常见严重并发症,主要致病菌有假丝酵母菌属和曲霉菌属.由于中性粒细胞减少、预处理相关的严重黏膜炎、急慢性移植物抗宿主病(GVHD)导致的皮肤和黏膜屏障损伤,糖皮质激素与其他免疫抑制剂治疗,导致造血干细胞移植患者容易发生IFI.     

上海市金山区50岁以上人群中甲状腺结节患者B超检查特点分析

目的 了解上海市金山区50岁以上人群甲状腺结节患者结节特点并据此提出健康干预和防治建议。 方法 2013年1-12月,通过分层整群随机抽样,对该区5个乡镇下属的13个居委会或村的2 362名50岁以上的居民进行问卷调查和甲状腺B超检查,运用SPSS 22.0进行数据分析。 结果 甲状腺结节患病率为40.6%,女性患病率(45.5%)显著高于男性(33.0%)(P<0.05);随年龄组增大,多发结节在50~岁、60~岁和70~岁人群中的比例依次为29.2%、32.0%和41.9%,呈升高趋势(P<0.05);60~岁(32.2%)和70~岁(42.1%)人群的双侧结节的比例高于50~岁(28.8%)(P<0.05);60~岁(23.4%)结节介于良恶性之间的比例高于50~岁(14.4%)(P<0.05)。 结论 金山区50岁以上人群甲状腺结节患病率女性高于男性,多发结节比例随年龄组增大呈现上升趋势,结节处于良恶性之间的患者比例较高,需引起卫生行政部门和医疗机构的重点关注。