两步法分离和培养人羊水来源胚胎间充质干细胞的生物学特征

背景：目前对干细胞的体外分离纯化技术大多是建立在对细胞表面标记识别的基础之上，包括单抗贴壁铺展法、流式细胞分选法、免疫磁珠分选法等，但操作复杂，价格昂贵。 目的：观察两步法分离和培养人羊水来源胚胎间充质干细胞的生物学特征。 设计、时间及地点：开放性实验，于2008-03/2009-03在新疆医科大学干细胞研究室完成。 材料：10例羊水标本来自怀孕16~22周行产前诊断或自愿引产的孕妇，在超声引导下行羊膜腔穿刺取得20~40 mL羊水。 方法：采用改进的两步培养法分离和培养人羊水间充质干细胞，首先同一步法将羊水标本离心、接种、培养至出现梭形细胞为主、类成纤维细胞的间充质干细胞集落。然后将上清培养液转移至新的25 cm2培养瓶中继续培养，至出现梭形细胞为主、类成纤维细胞的间充质干细胞集落且达70%汇合后消化，改用α-MEM培养基，同样添加碱性成纤维细胞生长因子，接种培养，记为第1代。 主要观察指标：①原代及传代羊水间充质干细胞形态学变化。②羊水间充质干细胞细胞核型、细胞周期、生长曲线和集落形成能力测定。③流式细胞仪、免疫荧光和RT-PCR检测表面抗原和细胞因子。 结果：实验成功分离、培养和传代人羊水间充质干细胞。①孕中期羊水细胞原代培养平均7 d可见散在的梭形细胞为主、类成纤维细胞的间充质干细胞集落；传代细胞在12 h内完全贴壁，经过一两天潜伏期后增殖迅速，培养六七天可达90%融合，细胞排列有一定的方向性，呈漩涡状、辐射状排列，细胞为长梭形，相互之间界限不清。②两种方法得到的羊水间充质干细胞染色体核型为正常二倍体核型；生长曲线均呈S形，但两步法在第(6.1±0.5)天就达到高峰，显著快于一步法第(7.2±0.6)天(P=0.035)。流式细胞仪检测结果显示两步法羊水P3细胞S期细胞占(14±2.3)%，显著多于一步法(9.0±1.4)% (P =0.031)。两种方法获得的羊水间充质干细胞低密度种植7 d后，均可形成散在的细胞集落，但两步法集落形成率为(15.0±2.3)%，显著多于一步法(10.0±1.8)%(P =0.021)。③流式细胞仪检测结果显示，羊水间充质干细胞表达CD44、CD29、CD105，而CD34、CD45、HLA-DR阴性；免疫荧光检测表明羊水中含有Oct-4阳性细胞，但两步法羊水间充质干细胞中Oct-4阳性细胞比例为(1.2±0.3)%，显著高于一步法(0.9±0.2)%(P =0.041)；RT-PCR分析表明两种方法获得的羊水间充质干细胞均表达Oct-4。 结论：人羊水中也存在间充质干细胞，两步培养法是一种高效、简便实用而且不干扰常规产前诊断程序的方法。     

不同组织冻存体系对牙周膜干细胞体外扩增的影响

背景：冻存是保证干细胞移植治疗的关键步骤之一。传统的冻存是将细胞直接置于冻存液中进行保存,然而冻存液中二甲基亚砜虽能减少细胞复苏过程中冰晶对细胞膜产生的机械性损伤,但同时又对细胞具有毒性作用,直接影响细胞生存状态,不利于临床移植治疗。目的：寻找适宜牙周膜干细胞体外扩增的牙周周组织冻存的最佳方案。方法：收集健康人牙,刮取牙周组织后将其平均分为3等份,随机分为新鲜组、5%二甲基亚砜组和10%二甲基亚砜组,后2组分别以体积分数5%和10%二甲基亚砜添加冻存1个月后提取牙周膜干细胞。新鲜组直接提取牙周膜干细胞。结果与结论：5%二甲基亚砜组原代细胞游出组织团块所需时间和细胞收获量虽不及新鲜培养组,但却明显优于10%二甲基亚砜组（P〈0.05）。新鲜组、5%二甲基亚砜组和10%二甲基亚砜组第1代牙周膜干细胞克隆形成率、活细胞比率、第3代牙周膜干细胞BrdU细胞增殖能力、MTT细胞生长曲线和牙周膜干细胞表面标志物表达差异没有显著性意义（P〉0.05）。提示5%二甲基亚砜添加冻存体系不仅能比10%二甲基亚砜添加的普通冻存体系明显缩短牙周膜干细胞体外扩增所需时间,增加细胞收获量同时还能保持细胞基本生物学特性,降低二甲基亚砜的总体用量和其在反复冻存复苏细胞过程中对细胞造成的直接损伤,为未来更加安全的实施临床移植治疗提供了保障,是供体组织储存新的选择。     

泡球蚴感染C57BL/6小鼠不同阶段Ⅲ型胶原的表达及意义

目的探讨Ⅲ型胶原(Col3a1)在泡球蚴感染C57BL/6小鼠早期(1月,Em-1m)和中期(3月,Em-3m)的表达变化及意义。方法采用门静脉注射法建立泡球蚴感染小鼠模型,分别于感染后1个月和3个月将小鼠处死,取肝脏,HE染色和天狼星红染色观察纤维化程度,免疫组化检测Col3a1的表达。用60μg/ml泡球蚴蛋白体外刺激人肝星状细胞(LX-2)12h、24h、48h和72h后,qRT-PCR检测LX-2细胞中Col3a1mRNA表达水平。结果 HE染色显示泡球蚴感染组小鼠发生肝脏纤维化。天狼星红染色显示泡球蚴感染Em-1m组和Em-3m组胶原纤维阳性面积与假手术组(Sham组)比较有统计学意义(Em-1mvs Sham-1m:8.14±0.84vs 1.00±0.37;Em-3mvs Sham-3m:34.40±5.07vs1.00±0.08,P0.01);Col3a1免疫组化检测阳性面积比值泡球蚴感染Em-1m和Em-3m组与假手术组比较有统计学意义(Em-1mvs Sham-1m:32.05±5.24vs 1.00±0.37;Em-3mvs Sham-3m:37.58±10.84vs 1.00±0.08,P0.01)。qRT-PCR结果显示60μg/ml泡球蚴组织蛋白刺激LX-2 72h后Col3a1mRNA相对表达量为1.29±0.49,与刺激12h时的Col3a1mRNA相对表达量0.35±0.08相比差异有统计学意义(P0.05)。结论随着泡球蚴感染时间的增加,小鼠肝脏Col3a1表达逐渐增加且纤维化程度加重。     

泡球蚴蛋白促进脂肪间充质干细胞向肝细胞分化的研究北大核心CSCD

目的 探讨泡球蚴蛋白(Echinococcus multilocularis protein,EmP)促脂肪间充质干细胞(Adipose tissue Derived Mesenchymal Stem Cells,ADSCs)向肝细胞分化的作用。方法 体外分离人脂肪组织来源的ADSCs,第三代(P3)ADSCs分为对照组(HDM肝细胞诱导分化组)和Em蛋白处理组(HDM+EmP组),经无血清肝细胞诱导培养基培养7、14和21 d,检测对照组和EmP处理组肝细胞样细胞(iHep)百分比、糖原染色面积、肝细胞标志物白蛋白(Albumin,ALB)的蛋白及基因表达水平。Western-Blot法检测p-GSK-3β的表达情况。结果 P3代ADSCs具有成脂及成骨分化能力并表达干细胞标志物(CD29、CD90和CD105等)。在ADSCs向肝细胞诱导分化14 d,EmP处理组iHep细胞百分比显著高于对照组(P<0.05),EmP处理组糖原染色面积显著高于对照组(P<0.05)。免疫荧光染色结果显示两组细胞在诱导分化7 d开始表达ALB,荧光强度随诱导时间增加呈增强趋势。qPCR结果显示在诱导分化后第14 d,EmP处理组ALB表达水平显著高于对照组,两组间具有统计学差异(P<0.05)。Western-Blot结果显示,诱导分化第7 d和14 d,EmP处理组p-GSK-3β蛋白表达水平显著高于对照组(P<0.01和P<0.05)。结论 Em蛋白可能通过激活GSK-3β而具有促进ADSCs向肝细胞分化的作用,本研究为临床应用ADSCs移植治疗泡型棘球蚴病奠定了基础。     

两步法分离和培养人羊水来源胚胎间充质干细胞及其向神经元样细胞诱导分化的实验研究

目的 建立两步培养法分离培养人孕中期羊水间充质干细胞(MSCs)的方法,观察羊水MSCs向神经元样细胞的诱导分化.方法 采用改进的两步培养法分离和培养人羊水MSCs,以β-巯基乙醇诱导其向神经元样细胞方向分化;并使用流式细胞术、逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和免疫细胞化学法研究人羊水MSCs的生物学特性.结果 成功分离、培养和传代出人羊水MSCs.流式细胞术检测人羊水MSCs表达CD44、CD29、CD105,不表达CD45、CD34、人白细胞DR抗原(HLA-DR);免疫荧光法和RT-PCR检测表明,部分人羊水MSCs表达转录因子Oct-4.两步培养法羊水MSCs集落形成率[(15.0±2.3)%]和Oct-4阳性细胞率[(1.2±0.3)%]均高于一步法[分别为(10.0±1.8)%,(0.9±0.2)%,P均<0.05].羊水MSCs经β-巯基乙醇诱导后细胞形态发生改变,伸出突起并呈神经球样改变;免疫细胞化学法检测显示(54.76±3.65)%的细胞表达神经元特异性烯醇化酶(NSE),同时(36.28±4.27)%的细胞表达神经胶质酸性蛋白(GFAP).结论 人羊水中存在MSCs,两步培养法是一种高效、简便、实用而且不干扰常规产前诊断程序的方法.在体外条件下,利用β-巯基乙醇和适宜的培养液可使羊水MSCs定向分化为神经元.     

转化生长因子β1刺激改良培养小鼠原代肝星状细胞的活化

背景：肝星状细胞是肝内分泌细胞外基质的关键细胞类型,因此在肝纤维化研究中很重要。 目的：实验改良了肝星状细胞原代培养方法,获得充足的细胞量,用转化生长因子β1刺激活化,研究致纤维化的相关因子表达情况。 方法：氯胺酮麻醉小鼠后采用门静脉穿刺原位灌注肝脏的方法分离肝脏,采用密度梯度离心获得肝星状细胞,利用形态学、免疫荧光染色等方法对原代肝星状细胞进行鉴定;将培养24 h肝星状细胞用质量浓度10 μg/L转化生长因子β1刺激48 h,同时设PBS组进行对比。 结果与结论：通过原位灌注肝脏并且酶消化的方法可以成功获得小鼠原代肝星状细胞,并且锥虫蓝染色活率为(97.2±0.8)%,免疫荧光染色纯度为(90.4±1.2)%,细胞计数总量约2.5×106/只。实时荧光定量聚合酶链式反应检测显示,与PBS组比较,转化生长因子β1刺激组的肝星状细胞平滑肌肌动蛋白α、Ⅰ型胶原蛋白、转化生长因子β受体1、转化生长因子β受体2 mRNA表达水平明显升高(P < 0.05)。结果证实,实验采用的改良的培养方法可更高效高质量的获得原代肝星状细胞,转化生长因子β1刺激可导致肝星状细胞活化,分泌致纤维化因子。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程      

AMPK信号通路及其在感染性疾病中的研究进展

腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase,AMPK)是一种AMP依赖性的蛋白激酶,负责调节细胞能量的合成与分解,是细胞生长、繁殖和自噬的关键调节剂。AMPK及其信号通路在病毒、细菌和寄生虫等感染中发挥了重要作用,有望成为一种药物新靶点。本文将对近年来AMPK信号通路在感染性疾病中的研究展开综述。     

深圳市0～36月流动儿童营养不良的分布特征及影响因素分析

目的了解深圳市社区0~36月流动儿童营养不良的分布特征,分析相关危险因素。方法采用整群抽样的方法,随机抽取两个社区,收集2015年在辖区社区健康服务中心体检的0~36月流动儿童体检资料,包括:问卷调查资料、体格检查资料、血红蛋白检测结果。应用Logistic回归分析,探讨营养不良的危险因素。结果共调查2 017例儿童,男1 095例,女922例,平均月龄为13.56±7.41个月。儿童总体营养不良检出率为6.15%,其中生长发育迟缓、低体重和消瘦检出率分别为3.47%、3.17%和1.83%。调整性别,年龄,家庭人均月收入后,反复呼吸道感染(OR=12.27,95%CI=6.51~23.13),反复消化道感染(OR=9.87,95%CI=5.93~16.45)是营养不良的独立危险因素,添加辅食时间(OR=0.66,95%CI=0.49~0.88)是营养不良的独立保护因素。结论该地区0~36月流动儿童营养不良检出率较高,应针对存在危险因素实施针对性干预,控制营养不良儿童的发生。     

全骨髓法培养C57小鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性

背景：饲养层细胞多数利用丝裂霉素C来处理,虽丝裂霉素C抑制了细胞增殖,但是细胞仍处于有分泌功能的活性状态,能够分泌不同的细胞因子。而骨髓中的非间充质骨髓细胞和血浆中的各种分泌因子,保持间充质细胞生长的微环境,提高间充质干细胞的产量。 目的：探究全骨髓培养法分离培养的小鼠骨髓间充质干细胞的生物学特性。 方法：采用全骨髓贴壁法纯化扩增C57小鼠的骨髓间充质干细胞,检测细胞增殖的动力学变化、细胞表面的免疫标志物、多向分化的潜能及细胞周期的变化。 结果与结论：全骨髓培养法获得的小鼠骨髓间充质干细胞具有黏附于塑料培养器皿的能力,流式细胞仪检测表达CD45,CD105和Sca-1,不表达CD34,CD133和C-kit等间充质干细胞的表面标记特征;细胞倍增时间（57.11＆#177;1.5） h;诱导后具有向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞分化的能力;细胞周期分析表明64%的细胞处于G 0-G 1期。提示全骨髓培养法获取的C57小鼠骨髓间充质细胞具有间充质干细胞的生物学特征。     

整合素β1在肝泡型包虫病患者肝脏中的表达及其与临床病理特征的相关性北大核心CSCD

目的检测肝泡型包虫病(AE)患者肝组织中整合素β1(Integrinβ1)的表达水平,并探讨其与患者临床病理特征的相关性。方法取73例AE患者肝脏组织样品及8例正常肝脏样品做石蜡组织切片,采用免疫组织化学染色法检测Integrinβ1的表达情况,分析Integrinβ1的表达水平与Child-pugh分级、PNM分型、血管新生等临床病理特征的相关性。结果AE患者病灶近旁及远端肝组织integrinβ1表达显著高于正常肝组织(P<0.01)。相关性分析显示Integrinβ1表达与AE患者PNM分型及新生血管数(Integrinβ1高表达组23.7±10.78,低表达组16.09±7.35)呈正相关(P<0.05),且随着AE病灶范围(P分期)的加重,Integrinβ1呈高表达(P1,0%;P2,13.6%;P3,75.0%;P4,50%)(P<0.01),而与患者年龄、性别、Child-Pugh分级等无显著相关性(均P>0.05)。结论肝泡型包虫病患者的肝组织高表达Integrinβ1,提示Integrinβ1可能参与AE病灶浸润过程,为阐明AE的致病机制和寻找新的药物靶标奠定了基础。