结核杆菌热休克蛋白—65重组质粒的构建及其在真核细胞中的初步表达

目的：构建结核杆菌热休克蛋白－65（HSP65）真核表达质粒,并探讨其在人肺癌细胞系A549中的表达,方法：用PCR的方法从结核杆菌H37Rv基因组中扩增出HSP65基因,并定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1( ）,构建成重组质粒pcDNA3.1-HSP65;然后用电穿孔的方法将质粒pcDNA3.1－65转染到A549细胞,经G418筛选后获得抗性细胞克隆;用RT－PCR的方法检抗性细胞中HSP65mRNA的表达,结果：经酶切鉴定和DNA序列测定证实重组质粒pcDNA3.1－HSP65构建正确;RT－PCR检测结果发现,重组质粒pcDNA3.1－HSP65转染的A549细胞总RNA中结核杆菌HSP65mRNA为阳性,结论：真核表达质粒pcDNA3.1－HSP65构建成功,并可在真核细胞A549细胞中稳定表达。     

荷瘤小鼠脾细胞NK活性及rhIL-2和rhIFN-α2a对其活性的影响

观察文氏腹水瘤荷病不同时期小鼠阵细胞NK活性的变化，并在体外检测重组人白细胞介素-2（rhIL－2）、重组人干扰素-a2a（rhIFN－a2a）对荷瘤八天小鼠脾细胞NK活性的影响。结果显示，荷病小鼠牌细胞NK活性在荷瘤第四天已明显降低（与对照组相比P＜0．001），第八天、第十二天NK活性继续降低，但荷瘤第八天和第十二天相比，血活性无显著性差异（P＞0．05）；rhIL－2和rhIFN－a2a对荷瘤八天小鼠NK活性均有明显的增强作用；但rhIL－2对荷瘤小鼠脾细胞NK活性的增强作用明显高于rhIFN－a2a（P＜0．001）。说明荷瘤小鼠脾细胞NK活性受到明显抑制，NK活性降低可用rhIL－2或rhIFN－a2a改善，但rhIL-2明显优于rhIFN－a2a。     

严重乙型肝炎活动进展为肝衰竭的预后因素分析

目的 旨在探讨影响严重肝炎活动预后的因素。方法 应用Logistic回归分析69例严重肝炎活动患者,探讨可能与进展成肝衰竭相关的临床和病毒学指标,包括HBV基因型、PC(G1896A)及BCP(A1762T/G1764A)变异;筛选出独立预测因素。结果 严重活动性肝炎患者中,33例(47.8%)进展成肝衰竭。多因素分析筛选出总胆红素升高(TB>256 μmol/dL, P=0.008)及凝血功能异常(PTA<40%, P<0.001)是严重肝炎活动进展为肝衰竭的危险因素。HBeAg阴性(P=0.065)、PC变异(P=0.090)与病情恶化有一定相关性。结论 血清总胆红素水平、凝血功能、HBeAg状态及PC变异在预测HBV相关的严重肝炎活动进展为肝衰竭中有预测价值。     

康宁胶囊联合拉米夫定治疗慢性乙型肝炎的疗效

目的观察康宁胶囊联合拉米夫定治疗慢性乙型肝炎(CHB)的临床疗效。方法将CHB患者分为康宁胶囊组、拉米夫定两药联合组共三组,治疗后6、12个月时,分别检测肝功能、血清肝纤维化指标和HBV病毒指标等,进行疗效评价。结果联合组治疗6、12个月时ALT、AST复常率分别为80.0%、87.5%和77.5%、87.5%,显著高于单药组;治疗6个月时,三组HA、LN、PIIIP、IV-C等肝纤维化指标均有明显下降,联用组下降更明显;治疗12个月时,联用组HBeAg转阴率、HBeAg/HBeAb转换率和HBV DNA转阴率分别为42.5%、30.0%、82.5%,HBV DNA转阴率显著高于单药组。结论康宁胶囊联用拉米夫定治疗,可提高HBeAg阳性CHB患者抗病毒的应答率和肝功能改善率,提高临床疗效。     

树突状细胞体外激活的CTL杀伤效应

目的 :研究树突状细胞 (dendriticcell,DC)激活的肿瘤特异性细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)的特异性杀伤效应。方法 :从人外周血中分离出外周血单个核细胞 (peripheralbloodmononuclearcell,PBMC) ,在GM -CSF和IL - 4的作用下培养 7天诱导出DC ,然后PBMC或DC为刺激细胞在体外诱导出HBsAg特异性CTL ;在调节好一定浓度靶细胞 (人肝癌细胞系HepG2及人肺腺癌细胞系A5 4 9)中加入效应细胞 (DC或PBMC) ,4 8h后瑞氏染色计数残存细胞数 ,计算杀伤率。结果 :DC激活的CTL对HepG2 杀伤率为 71.6 % ,而PBMC(APC ,非T细胞 )激活的CTL杀伤率为 4 3.8% ,两者有显著性差异 ,P <0 .0 1。此外 ,DC诱导的肝癌细胞抗原特异性CTL对肺癌细胞的杀伤率仅为 2 3%。结论 :DC诱导的CTL比PBMC高效 ,而且具有较高的特异性。     

HBsAg真核表达质粒及其诱导的小鼠特异性免疫应答

目的 研究HBsAg真核表达质粒pCI-S和pcDNA3.1-S在真核细胞中的表达和质粒DNA的免疫效果。方法 应用基因重组技术构建HBsAg真核表达质粒pCI-S和pcDNA3.1-S；经酶切和测序鉴定无误后，用阳离子脂质体介导的方法将重组质粒转染HepG2和COS-7细胞，48h后，再ELISA的方法检测重组质粒在细胞中HBsAg的表达，同时同质粒DNA免疫小鼠，用ELISA检测免疫小鼠血清抗-HBs抗体水平；用乳酸脱氢酶释放法检测小鼠肿瘤细胞HBsAg特异性CTL反应。结果 重组质粒pCI-S和pcDNA3.1-S转染的HepG2和COS-7细胞培养上清液和sAg均为阳性。DNA免疫小鼠血清可检测到高滴度的抗-HBs抗体，免疫小鼠脾细胞可检测到校强的HBsAg特异性CTL反应。结论 HBsAg真核表达质粒pCI-S和pcDNA3.1-S可在HepG2和COS-7细胞中高效表达，DNA免疫小鼠成功地诱导出抗-HBs和HBsAg特异性CTL反应。     

健康人外周血树突状细胞的体外培养扩增及其CDla等表面分子的表达分析

树突状细胞(DC)是一种功能最强的抗原提呈细胞,其最显著的特征是能够刺激初始型T细胞增殖,而B细胞和巨噬细胞只能刺激记忆型或被活化的T细胞,因此DC在免疫应答诱导中起重要作用。然而,由于DC在外周血中含量极低,因此限制了DC的研究和应用,所以,在体外分离扩增DC对DC     

HBsAg真核表达质粒的构建和鉴定

目的构建HBsAg真核表达质粒.方法用PCR的方法从质粒pEcob6中扩增出HBsAg基因,并定向克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(+),构建成重组质粒pcDNA3.1-S;然后用限制性内切酶消化和DNA序列测定鉴定.结果经酶切和DNA序列测定鉴定,证实重组质粒构建正确.结论真核表达质粒pcDNA3.1-S构建成功.     

HBsAg逆转录病毒表达质粒的构建及其在真核细胞中的表达

目的构建乙型肝炎表面抗原(HBsAg)逆转录病毒表达质粒并探讨其在真核细胞中的表达.方法用限制性内切酶从重组质粒pBKS-S中切出HBsAg基因,并亚克隆到逆转录病毒表达质粒pLXSN,构建成重组质粒pLXSN-S;经限制性内切酶消化和DNA序列测定鉴定无误后,用阳离子脂质体转染法将重组质粒pLXSN-S分别转染HepG2、K562和EB病毒转化B淋巴母细胞(EBVC);用ELISA法检测HBsAg在细胞培养上清中的表达.结果经酶切和DNA序列测定鉴定证实重组质粒构建正确;质粒pLXSN-S转染细胞培养上清均可检测到HBsAg.结论逆转录病毒表达质粒pLXSN-S构建成功并可在真核细胞中稳定表达.     

结核杆菌HSP70真核表达载体的构建

目的：构建结核杆菌HSP70重组真核表达质粒。方法：用PCR方法从结核杆菌H37RV基因组中扩增出结核杆菌HSP70基因DNA序列,应用T－A克隆技术,克隆到质粒GPEM－G vector, 经DNA测序证实基因碱基无误后,亚克隆到真核表达质粒PCDNA3．1（＋）,构建成PCDNA3．1－HSP70重组质粒。结果：经酶切鉴定,证实重组质粒构建正确。结论：结核杆菌HSP70真核表达载体构建成功。