构建检测心肌肌钙蛋白Ⅰ基因Arg145Trp突变的寡核苷酸探针*☆

目的：等位基因特异性寡核苷酸杂交是基于分子杂交原理而建立的经典的突变检测方法，也是DNA芯片技术的重要组成部分，常用于突变筛查。实验拟建立一种适合快速大规模检测心肌肌钙蛋白Ⅰ基因Arg145Trp突变(C4693T)的方法。 方法：实验于2002-07/2004-06在南京医科大学第一附属医院心血管病研究所临床生物学诊断与治疗实验室完成。直接测序研究证实的具有cTnⅠ基因Arg145Trp突变的肥厚型心肌病患者2例，正常对照1名，受试者对实验均知情同意。自外周血白细胞抽提DNA，聚合酶链反应扩增心肌肌钙蛋白Ⅰ基因含有突变位点的外显子，点于硝纤膜上，分别在不同的温度条件（48，52，56 ℃）下再与生物素标记的突变及野生探针杂交，摸索最佳杂交条件。根据最佳杂交条件，分别在100倍浓度无关探针条件下行非特异性竞争杂交，在100倍浓度未标记的特异寡核苷酸探针条件下行特异性竞争杂交。 结果：采用碱性磷酸酶标记的链霉亲和素和NBT/BCIP观察杂交结果：①突变及野生探针在48 ℃ 杂交时，除阴性对照外，2个患者及正常对照样本均见明显阳性信号。②在52 ℃ 及56 ℃ 条件下突变探针正确检出两个突变样本，但以56 ℃ 结果最佳。③100倍浓度无关探针杂交存在时，对生物素标记的突变寡核苷酸探针杂交结果没有影响，2个患者样本均见明显阳性信号。100倍浓度未标记的突变寡核苷酸探针存在时杂交，完全抑制生物素标记的突变寡核苷酸探针杂交结果。 结论：所设计的寡核苷酸探针能够检测出肥厚型心肌病患者心肌肌钙蛋白Ⅰ基因Arg145Trp突变（C4693T），适合该突变的快速大规模筛选。     

Expression of Inositol 1,4,5—trisphosphate Receptor mRNA in Myocardium of Spontaneous Hypertension Rats and Cultured Vascular Smooth Muscle Cells of Rats

Ｔｈｅｉｎｏｓｉｔｏｌ 1,4,5 ｔｒｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ (ＩＰ3)ｉｓｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄａｓａｋｅｙｓｅｃｏｎｄｍｅｓｓｅｎｇｅｒｏｒｏｎｅｏｆｔｈｅｅｌｅｍｅｎｔｓｏｆｓｉｇｎａｌｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ .Ｔｈｅｒａｐｉｄｒｅ ｌｅａｓｅｏｆＣａ2 + ｆｒｏｍｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＣａ2 + ｓｔｏｒｉｎｇｐｏｏｌｌｉｋｅｔｈｅｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍａｎｄｔｈｅｓａｒｃｏｐｌａｓ ｍｉｃｒｅｔｉｃｕｌｕｍｔｈｒｏｕｇｈｔｗｏｔｙｐｅｓｏｆｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｃａｌｃｉｕｍｒ…     

寻找一种诊治心肌损伤的新方法：鼠抗人cTnI单抗Fab段基因克隆和序列分析

背景：为将鼠抗人cTnI单克隆抗体应用人体进行体内诊断或作为治疗心肌损伤的药物载体，必须降低鼠源性抗体的免疫源性，克服其人抗鼠抗体反应，需要对其进行人源化改造。目的：克隆鼠抗人cTnI单克隆抗体Fab段基因并进行序列分析。设计：单一样本研究。单位：一所医科大学附属医院的心血管病研究所。材料：本实验于2003—01／2004—05在南京医科大学第一附属医院心血管病研究所完成。分泌鼠抗人cTnI单克隆抗体的杂交瘤细胞株(JS200202)由南京医科大学第一附属医院心血管病研究所提供。方法：设计扩增鼠IgG重链Fd段及K轻链引物，从分泌cTnI单抗的杂交瘤细胞中提取总RNA，RT-PCR扩增，对扩增产物进行分子克隆、测序及序列分析。主要观察指标：重链Fd段和K轻链基因序列及其所属亚型。结果：重链和轻链引物分别扩增出一约700bp和800bpDNA片段。经序列分析，与已发表的鼠IgG基因序列对比，其核苷酸及其所推导的氨基酸序列符合鼠IgG1 Fab段特征：在GenBank登录，登录号为AY484430(重链)，AY484431(轻链)；氨基酸序列登录号为AAR83243(重链)，AAR83244(轻链)。结论：本实验室获得了完整的鼠源性抗人cTnI单克隆抗体Fab段基因，为鼠抗人cTnI单克隆抗体的人源化改造奠定了基础。     

T型钙通道阻断剂对肥厚心肌L型钙通道电流及单细胞mRNA表达的影响

钙通道阻断剂咪拉地尔对T型钙通道有较高的选择性,在整体模型中对L型钙通道的作用尚不明确。本研究联合运用膜片钳技术及单细胞RT-PCR方法,研究二肾一夹肥厚     

钙调神经磷酸酶在肾血管性高血压大鼠心肌肥厚中的作用

目的　探讨钙调神经磷酸酶 (CaN)在肾血管性高血压大鼠心肌肥厚中的作用及抑制CaN活性对心肌肥厚的影响。方法　制备两肾一夹肾血管性高血压大鼠模型 ,术后 2月 ,经心脏超声证实大鼠心肌肥厚后 ,分别予环孢菌素A(CsA)或培多普利治疗。观察CsA、培多普利对大鼠心肌肥厚程度 ,CaNmRNA、蛋白质表达和CaN活性的影响。结果　两肾一夹术后 2月 ,手术组大鼠左室后壁和室间隔厚度均较假手术组增高 2 1 % (P <0 0 1 ) ,CsA治疗后较治疗前分别下降 1 6 %和 1 4 % (P <0 0 1 ) ,培多普利治疗后左室后壁和室间隔厚度亦较治疗前下降。同时大鼠左室心肌CaNmRNA和蛋白质表达、CaN活性均显著下降。结论　CaN参与肾血管性高血压大鼠心肌肥厚 ,抑制CaN活性可逆转心肌肥厚     

急性心肌梗死患者血小板反应素1单核苷酸多态性

目的探讨血小板反应素1基因第13外显子单核苷酸多态性致血小板反应素1蛋白第700位氨基酸丝氨酸转换为天冬氨酸与中国汉人急性心肌梗死的相关性。方法应用聚合酶链反应—限制性片断长度多态性技术筛查了汉族172例急性心肌梗死患者和270例对照者血小板反应素1基因第13外显子钙结合活性片段8831A→G,对筛查到含有突变的片段进行序列测定,并与正常序列进行对照分析,探讨两者之间的关系。结果血小板反应素1基因8831A→G不是中国汉人急性心肌梗死发生的独立危险因素(GA比AA:相对危险度为3.19,95%可信区间为0.578～17.61,P=0.160)。结论血小板反应素1基因8831A→G在汉人中发生频率低,与汉人急性心肌梗死发生无相关性,补充了血小板反应素1基因单核苷酸多态性的数据库信息。     

肾性高血压大鼠心、肾α_1肾上腺素能受体的变化

以3H-哌唑嗪为放射配基，测定肾性高血压大鼠不同药物治疗前后心肌α_1肾上腺素能受体的密度和亲和力，并观察血压。治疗前后心肌α_1受体无明显改变（P＞0．05）；治疗前肾脏α_1受体密度明显升高（P＜0.05），治疗后α_1受体恢复近正常，其改变与血压改变吻合；各组亲和力无明显变化。心肌和肾脏α_1受体可能以不同的亚型（α_1a，α_1b）为主。狭窄肾α_1受体调节可能与血压改变有关。     

不稳定型心绞痛患者血小板反应素-1基因 G1678A多态性分析

目的:探讨血小板反应素-1(TSP-1)基因G1678A(Ala523Thr)多态性与中国汉族人群不稳定型心绞痛(UAP)的关系。方法:应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)方法,检测110例UAP患者(UAP组)和319例非冠心病者(对照组)的TSP-1G1678A多态性。结果:TSP-1G1678A多态性AA、GA和GG基因型频率在UAP组和对照组的分布差异无统计学意义(AA,46.4%∶40.4%;GA,40.0%∶46.1%;GG,13.6%∶13.5%,均P>0.05)。A等位基因频率在UAP组(66.4%)和对照组(63.5%)分布差异也无统计学意义(P>0.05)。结论:TSP-1基因G1678A多态性与中国汉族人群UAP无显著相关性。     

妊娠相关血浆蛋白-A的纯化与鉴定

目的:建立人妊娠血浆相关蛋白A(PAPP-A)的纯化与鉴定方法.方法:利用DEAE-Sephdex CL-6B离子交换和Heparin-sepharose CL-6B亲和层析进行分离纯化,变性SDS-PAGE测定其相对分子质量为200 kD,Western blotting鉴定其特异性.结果:获得相对分子质量为200 kD的蛋白条带,此条带可与妊娠血浆相关蛋白A单克隆抗体发生特异性反应.结论:成功地从孕妇血清中分离得到妊娠血浆相关蛋白A.     

黄芪甲苷改善过氧化氢诱导的人主动脉内皮细胞氧化应激损伤的研究

目的：研究黄芪甲苷（astragaloside Ⅳ,AS-Ⅳ）对过氧化氢（H2O2）诱导的人主动脉内皮细胞（human aortic endothelial cells,HAECs）氧化应激损伤的改善作用。方法：体外培养的HAECs经饥饿处理后分为对照组、H2O2损伤组及AS-Ⅳ治疗组。H2O2损伤组细胞经H2O2（400 μmol/L)持续损伤36 h,AS-Ⅳ治疗组细胞经H2O2损伤12 h后加入含50 μg/mL AS-Ⅳ的培养基继续干预处理24 h。观察AS-Ⅳ对H2O2诱导的HAECs氧化应激损伤及线粒体功能损伤的修复作用。结果：H2O2损伤后HAECs 丙二醛（MDA）含量、NADPH氧化酶活性及线粒体活性氧（ROS）水平显著增加,超氧化物歧化酶（SOD）和锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD）活性及线粒体膜电位显著降低;H2O2损伤的HAECs 经AS-IV治疗后,HAECs的MDA含量、NADPH氧化酶活性及线粒体ROS含量明显降低,SOD和Mn-SOD活性及线粒体膜电位显著增高。结论：AS-Ⅳ对H2O2诱导的HAECs氧化应激损伤具有保护作用,提高线粒体的抗氧化功能是其可能的机制之一