含有小鼠CD40、IgG2aFc基因片段腺病毒的构建及检测

目的:构建载有小鼠CD40-IgG2aFc-IRS-GFP融合基因片段的腺病毒载体,并检测其转染293细胞后的融合蛋白表达及出毒情况.方法:提取小鼠CD40、IgG2aFc基因片段构建PDC316-IgG2aFc-IRS-GFP质粒,测序成功后包装构建Ad5-PDC316-CD40-IgG2aFc-IRS-GFP,转染293细胞.出毒后大量复制病毒并纯化,测定病毒滴度,体外感染细胞观察病毒复制及分泌目的蛋白情况并检测目的蛋白表达量.结果:成功构建了质粒及病毒,体外感染显示该病毒能有效地感染细胞并表达蛋白(荧光显示),检测目的蛋白表达量随时间点及浓度增加而增加.当病毒浓度增加到一定程度时目的蛋白表达趋于无明显差异性.结论:构建小鼠融合基因片段并成功转入细胞内、分泌表达目的蛋白是可行的,为进一步研究该病毒在大鼠体内感染及表达CD40Ig、大鼠肝移植模型免疫耐受及其机制的研究奠定基础.     

脂多糖对人脐静脉内皮细胞内皮细胞蛋白C受体和磷酸化P38表达的影响及参附注射液的干预作用

目的:观察脂多糖(LPS)培养的人脐静脉内皮细胞内皮细胞蛋白C受体(EPCR)和磷酸化P38的表达,并探讨参附注射液对其的干预作用.方法:分别在12、24、48 h采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、Western Blot技术测定正常对照组、LPS组、参附组培养的人脐静脉内皮细胞EPCR mRNA、蛋白及磷酸化P38蛋白的表达.结果:与正常对照组比较,LPS(24、48 h)组EPCR tuRNA、EPCR蛋白含量均显著下降(均P<0.01);与LPS(24 h)组比较,正常对照组、参附(12、48 h)组EPCR mRNA、EPCR蛋白含量均明显增高(均P<0.01).与正常对照组比较,LPS(24 h)组磷酸化P38蛋白含量显著增高(P<0.01);与LPS(24 h)组比较,正常对照组、LPS(12 h)组、参附(12、48 h)组磷酸化P38蛋白含量均明显下降(均P<0.01).结论:LPS可以从转录、蛋白水平减少人脐静脉内皮细胞上EPCR的表达,可能是通过P38 MAPK途径实现的:参附注射液可以调节LPS对人脐静脉内皮细胞上EPCR的表达的影响,从而对脓毒症起到防治作用.     

供肝转染含CD40Ig基因的腺病毒抑制大鼠肝移植急性排斥反应的研究

目的:通过腺病毒介导的CD40Ig基因治疗,阻断CD40/CD40L共刺激途径诱导免疫耐受,探讨CD40Ig对大鼠肝移植急性排斥反应的影响.方法:采用"二袖套管"法建立Lewis到BN大鼠肝移植急性排斥反应模型30只,A组10只为对照组;B组为病毒空壳组10只,术中肝脏冷保存前门静脉注射腺病毒空壳液1 mL(7×1010vp/mL);c组10只为实验组,肝脏冷保存前门静脉注射含有CD40Ig基因病毒液1 mL(7×1010vp/mL).分别于术后4、7、10 d每组各处死2只受体取血标本及肝组织,病理学检查肝组织及免疫组织化学检测CD40抗原的表达.ELISA法检测受体血清中的CD40Ig的表达,余大鼠观察生存情况.结果:C组移植大鼠平均存活时间延长至(53.25±13.37)d,较A组、B组明显延长(P＜0.01).C组肝脏急性免疫排斥明显减轻.A组、B组肝脏CD40抗原表达明显,C组未见CD40抗原明显表达.CD40Ig在受体内能成功表达,蛋白量于第7天最高,C组血中CD40Ig浓度明显高于A组、B组(P＜0.01).结论:重组CD40Ig基因的腺病毒能有效阻断T细胞共刺激途径,特异性抑制急性排斥反应,延长生存时间.     

C反应蛋白在危重甲型H1N1流感中的临床研究

目的 探讨C反应蛋白(CRP)水平在重症及危重甲型H1N1流感和肺部细菌感染患者中是否有区别.方法 对2009年9月23日-2010年1月20日,对多家医院收治的65例甲型H1N1流感(H1N1组)和37例肺部细菌感染患者(细菌感染组)的CRP水平、白细胞计数等进行比较.结果 与细菌感染组相比,H1N1组CRP计数明显降低(102.5±14.9,27.3±3.2),差异有统计学意义(P＜0.01),白细胞计数亦明显降低(16.1±2.1,6.7±0.9),差异有统计学意义(P＜0.05);CRP曲线下面积为0.904(CI=0.799～1.010);CRP浓度对于细菌感染的鉴别值为43.5 mg/L,其敏感性为86.7%,特异性为85.9%.结论 CRP水平可以帮助区别重症及危重甲型H1N1流感和肺部细菌感染患者.     

miRNA-221对肝癌HepG2细胞增殖及凋亡的影响

目的 通过构建慢病毒介导的miRNA-221-siRNA,探讨其下调miRNA-221对肝癌HepG2细胞系生物学行为的影响.方法 针对目标序列合成特异性siRNA干扰片段并克隆入慢病毒载体pGCSIL-GFP,将重组miRNA-221-RNAi-LV感染肝癌HepG2细胞系中,设为实验干扰组(miRNA-221-siRNA,SI组)、阴性对照组(negative control,NC组)和正常组(normal,N组);分别采用聚合酶链反应方法检测miRNA-221目的基因的表达情况;用噻唑蓝比色法检测增殖情况、transwell小盒迁移实验检测迁移情况、Hochest33258凋亡实验检测调亡情况.结果 (1) miRNA-221-RNAi-LV可显著降低miRNA-221的表达;(2) MTT实验96 h,SI组吸光度显著低于NC组和N组(P=0.003 2);(3)迁移能力明显减弱(P=0.000 4);(4)SI组细胞凋亡明显增加,促凋亡基因Caspase 3基因表达明显上调(P--0.000 2).结论 miRNA-221-siRNA通过抑制miRNA-221的表达抑制肝癌HepG2细胞增殖,促进肝癌HepG2细胞凋亡,降低其迁移能力.