医学微生物学选修课的开设与体会

针对医学微生物学学科知识量大，内容繁杂，传统教学中学生学习被动、依赖性强、积极性不高的问题，本教研室开设医学微生物学选修课，改变教学方式，激发学生的学习兴趣；拓宽了学生的知识面，增强了学生的社会责任感和历史使命感。     

沙眼衣原体主要外膜蛋白21-387的原核表达及其免疫原性

目的:探讨沙眼衣原体(Ct)E血清型主要外膜蛋白(MOMP21-387)的原核表达及其免疫原性。方法:利用PCR方法扩增Ct E血清型MOMP第21至第387氨基酸的基因序列,克隆至p ET21a(+)原核表达载体构建重组质粒p ET21a(+)/MOMP21-387,并进行原核表达和纯化,经SDS-PAGE和Western blot法分析鉴定后,通过BALB/c小鼠免疫检测MOMP21-387蛋白的免疫原性,即通过ELISA法检测小鼠血清Ig G和生殖道分泌物Ig A抗体反应,乳酸脱氢酶(LDH)法检测其脾细胞的特异性杀伤作用。结果:在原核表达系统成功表达了MOMP21-387融合蛋白,经SDS-PAGE及Western blot法鉴定在相对分子质量(Mr)约44 000处出现特异性条带;并经NiNTA亲和层析的方法获得了纯化的MOMP21-387融合蛋白,免疫BALB/c小鼠可诱导产生特异性血清Ig G抗体和生殖道分泌物Ig A抗体,至第6周达到高峰,MOMP21-387组的Ig G和Ig A抗体较PBS组差异均有统计学意义(P<0.05);LDH检测结果显示,MOMP21-387组小鼠脾细胞对靶细胞的杀伤率,在10:1、20:1和40:1和80:1时均明显高于PBS组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:Ct E型MOMP21-387融合蛋白具有良好的免疫原性,为基于MOMP21-387的Ct的ELISA法检测方法的开发和疫苗研究奠定了基础。     

HPV16型E7重组蛋白的表达及其多克隆抗体的制备

目的制备人乳头瘤病毒(HPV)16型E7原核表达蛋白及其多克隆抗体。方法用PCR方法从宫颈癌组织中扩增HPV16 E7基因,克隆至pET21a(+)载体并构建pET21a(+)/HPV16 E7重组质粒,测序鉴定;将重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3),经异丙基硫代-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导后表达重组蛋白,用Ni-NTA亲和层析法纯化并经SDS-PAGE及Western blot分析鉴定;纯化的HPV16 E7重组蛋白免疫日本大耳白兔制备多克隆抗体,用ELISA检测多克隆抗体的效价,并用Western blot法及免疫荧光技术分析多克隆抗体的特异性。结果 HPV16 E7重组蛋白可通过原核表达系统进行表达和纯化;通过兔免疫后可制备特异性的多克隆IgG抗体,效价达1∶30 000;经Western blot法和免疫荧光染色结果证实兔多克隆抗体可特异性识别HPV16 E7蛋白。结论成功进行了HPV16 E7原核表达并制备了HPV16 E7兔多克隆抗体。     

弓形虫棒状体蛋白2和膜表面蛋白1重组嵌合抗原免疫血清的制备与鉴定

目的 制备与鉴定弓形虫棒状体蛋白2（ROP2）和膜表面蛋白1（P30）重组嵌合抗原的特异性免疫兔血清。 方法 将已构建的重组质粒pET28b/ROP2-P30转化大肠埃希菌BL21-Codon Plus（DE3）-RIL菌株，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后，分离上清液和包涵体，包涵体用2 mol/L和4 mol/L尿素梯度洗涤去杂蛋白，最后用8 mol/L尿素溶解洗涤后的包涵体，进行十二烷基磺酸钠-聚丙稀酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），割胶回收目的蛋白，研磨成乳浊状后以背部多点注射免疫大白耳兔，制备免疫兔血清，以免疫扩散试验检测生成的特异性抗体，间接ELISA法测定免疫血清的抗体效价，蛋白质印迹（Western blotting）分析免疫血清的抗体特异性。 结果 免疫结束后，通过对流免疫扩散试验检测到了针对rROP2-P30的特异性抗体，间接ELISA法测定到其抗体滴度最高可达1 ∶ 12 800，Western blotting分析结果表明，此免疫血清与可溶性的重组蛋白、包涵体形式的重组蛋白均能特异性结合。 结论 得到了针对rROP2-P30重组嵌合抗原的特异性免疫血清。     

病毒样颗粒疫苗的应用前景

病毒样颗粒为一不含病毒核酸的空壳结构，与天然的病毒颗粒结构相似，具有很强的免疫原性和生物学活性，它在病毒感染的防治和血清学诊断方面具有广阔的应用前景。     

血吸虫微小RNA及其研究进展

血吸虫也称裂体吸虫,可致血吸虫病。血吸虫寄生于脊椎动物体内,而其幼虫在中间宿主螺体内发育。血吸虫体内存在众多微小RNA(micro RNA),参与调控自身生长发育以及与宿主间的相互作用。本文从血吸虫micro RNA的发现与鉴定、血吸虫micro RNA在不同发育阶段、不同性别及不同宿主中的差异表达以及血吸虫micro RNA潜在的应用价值等方面作一概述。     

研究生免疫学实验技术课程的开展与体会

免疫学实验技术课程是医学研究生教学中一门应用性很强的基础课。根据温州医学院研究生教学课程的情况,笔者就课程的设置,如何加强实验课教学,怎样培养学生动手能力和科研创新意识,以及培养学生逻辑思维能力和口头表达能力等方面的教学经验进行了总结。     

HPV 16型L2全长原核融合蛋白的交叉反应特性研究

目的 研究HPV 16型L2全长蛋白在HPV6、11、16和18型别间的交叉反应特性.方法 收集108例尖锐湿疣患者、156例宫颈癌患者和100名健康对照者的血清标本,采用PCR法从宫颈癌患者组织DNA中扩增HPV16 L2全长基因,将其克隆至原核表达载体PGEX-4T-1中,构建重组质粒PGEX-4T-1-HPV16 L2,将鉴定正确的重组质粒转化至E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和WB鉴定;进一步通过WB检测HPV16 L2全长融合蛋白与HPV6、11、16和18型DNA检测阳性的患者血清的特异性结合能力.以镍螯合亲和层析柱(Nj-NTA Agarose)纯化HPV16 L2融合蛋白作为包被抗原,采用间接ELISA法检测3组标本中的HPV血清特异性IgG抗体.结果 成功构建了重组质粒PGEX-4T-1-HPV16 L2,含有HPV16 L2的融合蛋白在原核表达体系中呈较高效表达,表达量为27.2%;SDS-PAGE和WB检测结果显示在约相对分子质量82 000处可见特异性阳性信号条带;以HPV6、11、16和18 DNA阳性患者血清为一抗的WB结果显示,HPV16 L2全长融合蛋白在相对分子质量82 000处均出现特异性阳性信号条带.ELISA结果显示,尖锐湿疣组、宫颈癌组和健康对照组血清抗体A值分别为0.825±0.409、0.808±0.376、0.128±0.15,阳性率分别为92.6%、92.3%和6.0%.3组间血清抗体A值及阳性率差异均具有统计学意义(H=207.292,x2=251.846,P均＜0.01),而尖锐湿疣组与宫颈癌组之间的血清抗体均值(0.825和0.808)差异无统计学意义(H=0,P＞0.05).结论 HPV16 L2全长原核融合蛋白具有较强的抗原性,与HPV6、11、16和18型别间具有交叉反应,可进一步用于HPV感染及其相关肿瘤ELISA血清学检测试剂的通用型靶抗原研究.     

解脲支原体3血清型和14血清型多带抗原B细胞表位预测

目的 预测解脲支原体(Ureaplasma urealyticum,Uu3和14血清型多带抗原(multiple banded antigen, MBA)的优势B细胞表位和Th表位。方法 利用GOR4和HNN方法预测Uu3和Uu14血清型MBA的二级结构,结合其跨膜区域、亲水性、极性、柔韧性、表面可能性和抗原性等方面特征,预测其优势B细胞表位;同时筛选MHC-Ⅱ类限制性Th表位。合成4个富含B/Th细胞多表位肽,免疫小鼠评价其免疫原性。结果 Uu3血清型和14血清型MBA的B、Th表位具有高度同源性,其共同的富含B/Th细胞抗原表位位于N端31-51、55-75、97-115和154-168肽段。MBA aa31～51 ( F1)、MBA aa 55～75( F2)、MBA aa 97～115( F3) 及MBA aa 154～168 ( F4) 4个多表位肽具有良好的免疫原性,其诱导产生的特异性抗体明显高于PBS对照组(P<0.01)。结论 多参数预测Uu MBA B细胞优势表位可为MBA单克隆抗体的制备和Uu表位疫苗设计等研究提供理论依据。     

新型冠状病毒E蛋白结构与免疫优势表位的信息学预测分析

目的：应用生物信息学方法预测和分析新型冠状病毒（SARS-CoV-2）包膜蛋白（E蛋白）的结构及免疫优势表位。方法：从NCBI GenBank数据库中检索SARS-CoV-2 E蛋白的氨基酸序列，通过Expas y服务器上的软件分析预测其理化性质、二级结构、跨膜区域；并结合其亲水性、表面可及性、极性、抗原性和柔韧性等综合分析，预测其可能的B细胞表位；利用Net CTL1.2 server预测CTL表位；通过Vector NTI对冠状病毒属E蛋白进行同源性分析；同时应用Swiss Model对E蛋白进行三维结构同源建模及功能结构域预测分析。结果：SARS-CoV-2 E蛋白由75个氨基酸残基组成，为跨膜蛋白，跨膜区域以α螺旋为主；E蛋白可能含有2个B细胞表位和6个CTL表位，其免疫优势表位区域分别位于其N端16-34aa和C端50-70aa区段；SARS-CoV-2与SARS-CoV和Bat-SARS-like-CoV E蛋白的免疫优势表位存在极高的同源性；其疏水性跨膜结构和PDZ结合基序分别位于N端12-34aa和C端72-75aa区段。结论：E蛋白为跨膜蛋白，其氨基酸序列的16-34和50-70区段可能为免疫优势表位。