HPV18 E7基因的原核表达及其在宫颈癌患者血清抗体中的检测

目的研究人类乳头瘤病毒18型E7全长基因(HPV18 E7)在原核表达系统中的表达,及其作为特异性抗原在宫颈癌血清抗体检测中的意义,为HPV感染与肿瘤相关的血清学诊断研究奠定基础。方法PCR法扩增HPV18 E7全长基因,构建重组质粒pET32a(+)/HPV18 E7,转化表达HPV18 E7融合蛋白后经纯化、SDS-PAGE和Western blot分析鉴定。再以该融合蛋白作为诊断抗原,间接ELISA法检测宫颈癌、尖锐湿疣及健康对照三组血清特异性IgG抗体水平。结果HPV18 E7融合蛋白表达量约占菌体总蛋白的35.00%;宫颈癌、尖锐湿疣及健康对照组的血清特异性抗体均值分别为0.604±0.328,0.287±0.202和0.342±0.225,三组间差异有显著性意义(F=32.771,P<0.01);宫颈癌组与尖锐湿疣组及健康对照组的HPV18E7均值比较,差异均有显著性意义(P均<0.01),而尖锐湿疣组与健康对照组抗体均值比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论HPV18 E7融合蛋白具较强的抗原性,对宫颈癌诊断试剂的研究具有应用价值。     

EB病毒膜蛋白家兔免疫血清的制备及其特性研究

目的：制备高效价EB病毒膜蛋白抗体,并对其效价及其与EBV结合的特异性进行鉴定。方法：将B95-8细胞培养至3×10^5/mL时,超声破碎,纯化获得EB病毒膜蛋白抗原;EB病毒膜蛋白抗原经弗氏佐剂乳化,在家兔背部皮下多点免疫注射,间隔2周免疫,共3次,并分别于免疫前和每次免疫后1周取兔血清,检测兔免疫血清抗体IgG;进一步采用Western blot检测制备的血清抗体与EBV结合的特异性,同时采用ELISA法检测兔血清抗体水平及各周抗体滴度的变化趋势。结果：所有家兔在全程免疫后都产生了高效价膜蛋白的特异性抗体,最高滴度达1：6400。结论：用B95-8细胞制备的EB病毒膜蛋白抗原免疫家兔,可成功制备高效价的特异性血清抗体,为EB病毒膜蛋白抗原的免疫学检测奠定了基础。     

EB病毒潜伏膜蛋白2的二级结构分析和B细胞表位预测

目的:预测EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2(LMP2)的二级结构和B细胞表位.方法:以EBV标准株(B95.8)LMP2的完整氨基酸序列为基础,采用SOPMA、GOR、nnPredict和HNN四种方法分别预测LMP2的二级结构;并结合其跨膜区域、亲水性、表面可及性、抗原性、极性和柔韧性等进行综合分析,预测EBV LMP2的B细胞优势表位.结果:四种方法对EBV LMP2二级结构的预测均表明,其二级结构中柔性区域以无规卷曲为主,少见转角.B细胞优势表位可能位于其N端199～209、318～322和381～391区段.结论:用多参数预测EBV LMP2的二级结构和B细胞优势表位,可为其单克隆抗体的制备和表位疫苗设计等研究提供理论依据.     

人乳头瘤病毒16 L1/CFA CTL表位融合蛋白的原核表达研究

目的:构建人乳头瘤病毒(HPv)16型衣壳蛋白L1与癌胚抗原(CEA)细胞毒T细胞(CTL)表位嵌合基因,探讨其在原核表达系统中的表达情况.方法:选择CEA CTL表位(CEA691 IMIGVLVGV),以HPVl6阳性宫颈癌组织提取的DNA为模板,通过PCR方法扩增出HPVl6 LI/CEA CTL表位嵌合基因,克隆入pET32a( )表达载体,转化大肠杆茵BL21(DE3),经IPTG诱导表达融合蛋白,通过Ni-NAT离子交换柱层析纯化,进一步采用SDS.PAGE和Western-blot分析鉴定.结果:pET32a( )/HPVl6 L1/cEA CTL表位重组质粒构建成功,并在大肠杆菌中得到表达.SDS·PAGE分析表明表达产物分子质量(Mr)约为83 X 10.,与预期相符,Western-blot方法进一步证实其为目的蛋白.结论:利用pET32a( )表达载体能表达HPVl6 L1/cEA CTL表位重组蛋白,为其进一步的免疫效应研究打下了基础.     

沙眼衣原体主要外膜蛋白生物信息学分析

目的：分析和预测E血清型沙眼衣原体（Ct）主要外膜蛋白（MOMP）的结构和功能。方法：采用计算机辅助生物软件和网络数据库,从SwissProt蛋白质数据库中检索MOMP氨基酸序列,用Expasy服务器分析预测MOMP蛋白理化性质、二级结构,同时用Pcons服务器分析模拟蛋白质空间结构。结果：分析显示,Ct MOMP蛋白为一跨膜16次的酸性蛋白质,其空间结构为β-桶状膜蛋白,推测其功能为孔蛋白。结论：通过对MOMP生物信息学分析获得该蛋白的特性,为进一步研究Ct的感染与发病机制、研制Ct亚单位疫苗以及研究MOMP新的功能域等提供理论依据。     

肿瘤相关抗原CEA的B细胞表位预测

目的分析癌胚抗原（carcinoembryonic antigen,CEA）的B细胞表位,为肿瘤治疗提供理论基础。方法以CEA的完整氨基酸序列为研究基础,采用Hopp＆Woods的亲水性方案,Emini表面可及性方案和Jameson-Wolf抗原指数方案,辅以CEA的二级结构及其柔性区域分析,预测CEA的B细胞表位。结果预测的B细胞表位可能位于CEA的N端第150～160、168～172、207～211、332～338、372～377、467～472、485～490、507～516、580～584区段。结论应用多参数预测CEA的B细胞表位,可进一步用于CEA相关肿瘤治疗性表位疫苗的分子设计和研究。     

HPV 6b结构蛋白L1和沙眼衣原体CTL表位嵌合病毒样颗粒在昆虫细胞中的表达

目的为研制能同时防治人乳头瘤病毒(HPV)和沙眼衣原体(Ct)的嵌合疫苗。方法将Ct主要外膜蛋白(MOMP)插入到HPV衣壳蛋白L1羧基端,通过PCR、酶切、连接等方法构建了杆状病毒表达载体,进一步在大肠杆菌中组装成重组杆状病毒,经感染昆虫细胞表达嵌合病毒样颗粒,并经SDS-PAGE电泳和Westernblot分析鉴定,电镜负染。结果嵌合蛋白HPV6bL1/CtMOMP249-268在昆虫细胞中得到了表达,表达产物的相对分子质量为56000,与HPV6bL1单抗产生特异性反应,电子显微镜观察到病毒样颗粒形成。结论在昆虫细胞中表达的含HPV6bL1和CtCTL表位的嵌合蛋白,能自行组装成病毒样颗粒,为人乳头瘤病毒和沙眼衣原体嵌合疫苗的研究奠定基础。     

EB病毒潜伏膜蛋白2多表位的原核表达及其抗原特性分析

目的 对EB病毒(EBV)潜伏膜蛋白2(LMP2)中富含T、B细胞多表位肽段基因进行原核表达,并分析该多表位蛋白的抗原特性.方法 利用计算机在线软件预测EBV LMP2蛋白的CTL表位、Th表位.选取富含CTL表位和Th表位的肽段,兼顾其上下游已预测的B细胞表位,组成含多个T、B细胞表位的EBV LMP2多表位,该多表位基因序列经原核密码子优化后全序列合成,并克隆入原核表达载体pET32a(+)得到pET32a(+)/EBV-LMP2多表位重组质粒,经IPTG诱导在E.coli BL21(DE3)表达并纯化,经SDS-PAGE和Western blot分析鉴定;采用EBV膜蛋白家兔免疫血清和鼻咽癌患者血清进行Western blot分析其抗原特性;并利用EBV-LMP2多表位蛋白免疫BALB/c小鼠,分别采用LDH和ELISA方法检测小鼠脾细胞特异性CTL杀伤效应及血清特异性抗体IgG水平,以分析该表位蛋白的免疫原性.结果 LMP2(aa195-232)和LMP2(aa419-436)肽段富含CTL、Th和B细胞表位,将其串联后作为EBV LMP2多表位,该多表位基因在大肠杆菌中获得了表达.表达产物的相对分子质量(Mr)约27×103,与预期Mr相符;经Western blot证实EBV-LMP2多表位具有抗原特异性,可被EBV膜蛋白家兔免疫血清和鼻咽癌患者血清特异性抗体识别;小鼠免疫结果显示EBVLMP2多表位可诱导机体产生特异性的CTL杀伤效应,随着效靶比(1:5,1:10,1:25)增加,CTL杀伤活性逐渐增强(12.52%±2.59%,21.80%±1.08%,23.68%±3.74%),同时产生了特异性血清IgG抗体反应(A490=0.258±0.040),与对照组比较差异均具有统计学意义(P＜0.05).结论 本研究没计的EBV-LMP2多表位具有良好的抗原性和一定的免疫原性.     

沙眼衣原体主要外膜蛋白多表位免疫血清中和活性分析

目的 制备高效价E型沙眼衣原体(Ct)主要外膜蛋白(MOMP)168多表位特异性免疫血清并研究其免疫学特性.方法 纯化的Trx-his/Ct MOMP168融合蛋白经弗氏佐剂乳化后,小鼠背部皮下多点免疫注射,间隔2周后加强免疫,共3次,并分别于免疫前和每次免疫后2周取血,采用ELISA法检测血清融合蛋白和E型Ct全菌体特异性抗体水平及变化趋势,通过体外中和反应检测多表位特异性血清的免疫学特性.结果 小鼠用Ct MOMP168多表位融合蛋白全程免疫后产生了抗融合蛋白和E型Ct全菌体特异性抗体,ELISA法检测最高滴度达1:500.ELISA和体外中和实验检测结果显示,该抗体能特异性识别MOMP 多表位蛋白和E型Ct全菌体,并能有效抑制E型Ct感染Hela229细胞.结论 沙眼衣原体MOMP多表位融合蛋白免疫血清可特异性结合并中和E型Ct.     

人类表皮生长因子受体2的B细胞表位初步预测分析

目的预测人类表皮生长因子受体2（HER2/neu）的B细胞表位,为肿瘤免疫治疗提供理论基础。方法以生物信息学软件综合预测筛选HER2/neu可能B细胞表位,以吴氏平均抗原性指数为标准,确定目的表位。结果HER2/neu为一跨膜蛋白,其二级结构中以无规则卷曲的区域出现较多。其N端第497～504,939～943,1 106～1 116,1 140～1 158,1 166～1 175,1 225～1 234,1 240～1 246区段,可能为HER2/neu的优势B细胞表位。结论应用多参数预测HER2/neu的B细胞表位,可进一步为HER2/neu相关肿瘤治疗性表位疫苗分子设计和研究提供理论依据。