小鼠趋化因子COL19Ig融合蛋白表达载体的构建、表达及鉴定

通过特异引物扩增出去掉终止密码的mCCL19编码序列，经酶切、亚克隆、拼接构建了真核表达载体pcDNA3．1-CCL19Ig，酶切和测序鉴定插入序列；将重组质粒转染CHO细胞进行体外表达，通过RT—PCR、Western blot鉴定目的基因的表达，利用趋化小室法测趋化活性。结果测序证实重组表达载体含mCCL19编码序列和人IgGI Fc段序列，其序列分别与GenBank中公布序列比对一致，IgG1-Fc段读码框未发生改变；Western blot结果证实转染了pcDNA3．1-mCEL19Ig的CHO细胞培养上清中有相对分子质量为38000的融合蛋白mCCL19Ig表达；体外趋化实验表明融合蛋白mCCL19Ig对小鼠脾细胞有趋化活性，且呈剂量依耐关系。     

回结肠代膀胱术临床分析(附25例报告)

目的　探讨回结肠代膀胱术的临床疗效。　方法　对 2 5例膀胱肿瘤患者膀胱全切除术后 ,应用末段回肠及盲升结肠作贮尿囊行正位膀胱重建术。　结果　 2 5例中获随访 2 2例 ,随访时间 6～ 3 4个月 ,平均 19.5个月。患者一般于术后 3周自主可控性排尿 ,日间排尿可控率 91% ,1年夜间尿失禁 2 6%。术后 6个月尿动力学检查膀胱容量 (3 86± 75)ml(2 90～ 550ml)、最大尿流率 (12 .5±2 .2 )ml/s、剩余尿量 (2 6± 11)ml ,充盈期膀胱压力明显低于尿道闭合压。输尿管返流 2例 ,无尿道狭窄、输尿管狭窄 ,无高氯性酸中毒 ,肾功能正常。 1例术后 8个月发生肿瘤多处转移 ,余 2 1例无瘤存活。　结论　回结肠代膀胱术具有膀胱容量大、内压低 ,正位排尿 ,可控性好 ,并发症少等优点 ,患者易于接受 ,是一种较理想的尿流改道方式     

稳定高表达Uroplakin Ⅱ基因人膀胱癌细胞株的建立及其意义

目的　建立稳定高表达UroplakinII(UPII)基因的人膀胱癌细胞株。方法　采用分子克隆技术构建含全长UPII结构基因的真核表达载体 ,进行酶切鉴定、核酸序列分析 ,并将其在阳离子脂质体Lipofectamine 2 0 0 0的介导下转染UPII基因缺陷型膀胱移行细胞癌 (TCC)细胞株EJ ,经G418筛选获得抗性亚克隆细胞株 ;逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)、Westernblotting方法对亚克隆细胞株进行UPII基因表达鉴定。结果　所获UPII基因真核表达载体pcDNA3 UPII转染EJ细胞后 ,通过G418持续压力筛选 4周获得亚克隆细胞株EJ/UPII ;RT PCR、Westernblotting均未检测到EJ细胞的UPII基因表达 ,而EJ/UPII细胞中UPIImRNA和蛋白表达水平显著增高 (P <0 .0 1)。结论　通过基因转染方法建立了稳定高表达UPII基因的膀胱TCC细胞株 ,为进一步探讨UPII基因在膀胱TCC生物学行为中的作用及其靶向生物治疗策略奠定了基础。     

芹黄素提高胸苷激酶基因系统治疗前列腺癌疗效的研究

目的　观察芹黄素 (apigenin)对前列腺癌 (PC)细胞PC 3m生长的影响及其对单纯疱疹胸苷激酶 /更昔洛韦 (HSV tk/GCV)系统“旁观者效应”的调控 ,寻求增强该系统对PCa疗效的途径。方法　四甲基偶氮唑盐比色法 (MTT法 )检测 1、10、10 0 μmol/Lapigenin对PC 3m细胞生长的影响 ,观察 10 μmol/Lapigenin预处理后GCV对tk基因阳性 (tk+ )比例为 10 %和 5 %的混合细胞的杀伤作用及 18 α 甘草次酸 ( 18 α glycyrrhetinicacidAGA)对其影响 ,并检测apigenin联合GCV的杀伤效应。结果　Apigenin可抑制PCa细胞增殖 ,呈时间和剂量依赖关系 (P <0 .0 5 0 ) ;低浓度( 10 μmol/L) apigenin预处理对PC 3m细胞增殖无影响但可使“旁观者效应”明显增强 (P <0 .0 0 1) ,10 μmol/L和 10 0 μmol/LGCV对tk+ 为 10 %细胞的杀伤率由 ( 16.15± 1.64 ) %和 ( 2 3 .46± 3 .2 1) %提高到 ( 4 5 .89± 3 .2 8) %和 ( 5 9.86± 2 .44 ) % ,该作用可被AGA抵消。联合应用apigenin和GCV后杀伤率更为显著 ,达 ( 62 .5 8± 4.2 9) %和 ( 83 .16± 3 .72 ) %。结论　Apigenin不仅可以直接杀伤PC细胞 ,还可通过增强HSV tk/GCV系统“旁观者效应” ,发挥间接杀瘤效应 ,从而提高该系统治疗PC疗效。     

经皮肾镜取石术治疗复杂性肾结石96例报告

目的：探讨二维超声引导下经皮肾镜取石术治疗复杂性肾结石的安全性和有效性。方法：对2010年～201i年收治的96例复杂性肾结石患者行二维超声引导下经皮肾镜取石术。总结治疗手术时间、结石清除率、严重并发症发生率。结果：96例患者均在超声引导下建立取石通道进行手术,其中1例因术中严重出【血停止手术,其余均顺利手术取石,平均手术时间85（60～120）min。术后复查KUB、超声,一次结石清除率为56．2％（54／96）。术后发生严重出血需行选择性动脉栓塞2例,未发生气胸、肠管损伤等并发症。结论：二维超声引导下经皮肾镜取石术能安全、有效治疗复杂性肾结石。     

膀胱癌组织中X-染色体连接的凋亡抑制蛋白表达及其对化疗敏感性的影响

目的探讨X-染色体连接的凋亡抑制蛋白(XIAP)在膀胱癌组织中的表达及其对化疗敏感性的影响。方法采用免疫组织化学方法检测6例正常膀胱黏膜上皮组织、47例膀胱移行细胞癌组织中XIAP的表达。脂质体方法介导XIAP基因转染膀胱癌T24细胞,通过G418进行稳定筛选。逆转录聚合酶链反应检测转染前后T24细胞内XIAP的表达。分别采用0．005 mg/ml、0．05 mg/ml低剂量丝裂霉素诱导凋亡启动,MTT比色分析检测癌细胞生长活性,3’末端脱氧核苷酰转移酶介导生物素标记法检测细胞凋亡率。结果膀胱癌组织中XIAP呈中度阳性表达,阳性率78．7%,其阳性率与肿瘤分级和分期无关(P＞0．05)。转染XIAP后T24细胞高表达XIAP,与未转染XIAP组比较,XIAP mRNA表达增高3．8倍。0．005 mg/ml丝裂霉素作用下转染组细胞生存率较对照组上升(11．60±0．25)%、凋亡率下降(10．1±0．2)%(P＜0．05)。0．05 mg/ml丝裂霉素作用下转染组细胞生存率较对照组上升(16．51±0．87)%、凋亡率下降(11．9±0．2)%(P＜0．05)。结论XIAP在人类膀胱癌中呈中高度表达,XIAP表达升高可明显降低化疗药物诱导的膀胱癌细胞凋亡,提示其可能影响化疗的敏感性。     

携带报告基因EGFP的CXCR4 RNA干扰质粒的构建及生物活性的鉴定

目的构建携带报告基因EGFP的CXCR4RNA干扰质粒,证实其高效抑制靶基因表达的生物活性。方法设计有发夹状结构的两条DNA序列,用PCR扩增CXCR4特异性小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA),转入带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)和启动子U6的pGensil-1质粒,转化DH5a菌株,提取质粒行酶切及测序鉴定。重组质粒转染PC-3m细胞株,检测绿色荧光蛋白表达及对细胞CXCR4表达的抑制情况。结果成功构建了CXCR4靶向的RNA干扰质粒pGensil-1/siCXCR4,在靶细胞可同时表达siRNA及绿色荧光蛋白。结论pGensil-1/siCXCR4质粒的成功构建对利用基因干扰技术治疗前列腺癌转移方面的研究奠定了一定的实验基础。     

凋亡抑制因子Livin在膀胱移行细胞癌组织中的表达及意义

目的：研究凋亡抑制蛋白家族(IAP家族)新的凋亡抑制因子Livin在膀胱移行细胞癌(BTCC)中的表达及其与肿瘤分级、分期、复发之间的关系。方法：采用免疫组织化学SP法,对54例BTCC和8例正常膀胱组织中Livin的表达情况进行检测,分析其在膀胱癌组织和非膀胱癌组织中的表达及其与肿瘤病理学分级、临床分期和患者复发情况的关系。结果：Livin在8例正常膀胱组织中均不表达,而在54例膀胱移行细胞癌组织中表达率为85．2%(P＜0．01)。Livin的表达和膀胱移行细胞癌的病理分级、临床分期、是否复发无明显相关(P＞0．05)。结论：细胞凋亡抑制因子Livin在BTCC组织中表达上调,提示Livin可能通过抑制细胞凋亡,对BTCC的发生发展起重要作用;Livin在膀胱癌中的高表达有望成为一种有效、敏感的瘤标,并为BTCC的基因治疗提供新的靶点。     

肾移植术后肝细胞生长因子的动态监测及临床意义

目的:探讨肝细胞生长因子(HGF)在急性排斥反应的早期诊断、鉴别诊断中的意义。方法:采用双抗体夹心酶联免疫吸附法,对50例肾移植受者血清HGF水平在手术前后进行动态监测。观察肾移植术后发生急性排斥反应(AR)、急性肾小管坏死(ATN)、环孢素(CsA)中毒时血清HGF的变化。结果:术前组HGF水平与对照组相比有统计学意义(P<0.05)。稳定组术后前3天HGF下降明显,2周左右降至对照组水平。AR组在典型症状出现及血Cr升高前1~3d,HGF即有升高,且峰值出现在抗排斥治疗的当天。经甲基泼尼松龙冲击后AR逆转者HGF迅速下降。ATN组HGF升高,与AR组相比有统计学意义(P<0.05)。CsA中毒组HGF水平升高,与AR相比有统计学意义(P<0.05),但与ATN组相比无统计学意义(P>0.05)。结论:动态监测HGF可能作为急性排斥反应的早期诊断敏感指标,并且对ATN、CsA中毒的鉴别诊断也具有一定临床应用价值。     

胸腺素β4基因沉默对膀胱移行细胞癌上皮间质转化的逆转作用

目的 观察胸腺素β4(Tβ4)基因沉默对膀胱癌细胞上皮间质转化(EMT)的逆转,探讨其在肿瘤侵袭转移中的作用机制.方法 使用针对Tβ4的慢病毒载体(knti-Tβ4)转染膀胱癌细胞株T24.采用定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot法检测Tβ4、整合素连接激酶(ILK)和上皮性标记基因E-cadherin、β-catenin的表达改变;Immunofluorescence法检测ILK、E-cadherin、β-catenin在转染后124细胞中的表达改变;细胞划痕实验、Boyden小室体外侵袭实验、AO/EB荧光染色法反映细胞转移潜能和凋亡的变化.结果 转染后48 h的T24细胞,Tp4、ILK、β-catenin mRNA或蛋白表达开始下降,以转染后96 h明显;而上皮标记基因E-cadherin在转染96h后,表达显著增加(P<0.05);Immunofluorescence显示ILK和β-catenin在细胞质、细胞核中表达减弱,而E-cadherin在胞膜中表达增强,细胞形态向正常上皮细胞转化;转染后的324细胞体外迁移能力与侵袭力下降[(10.4±1.2)%比(73.5±1.4)%],细胞凋亡增多(12.3%比36.6%).结论 肿瘤细胞中的Tβ4表达下调可以逆转肿瘤细胞的间质表型,而向正常上皮表型转化,降低肿瘤转移潜能.