辛德毕斯病毒荧光PCR检测方法的建立

目的建立辛德毕斯病毒核酸的SYBRGREENΙ荧光PCR检测方法。方法根据辛德毕斯病毒基因组核苷酸序列特性设计引物。病毒在BHK21细胞上繁殖扩增后提取RNA和逆转录。以病毒cDNA为模板分别进行SYBRGREENΙ荧光PCR和常规RTPCR扩增,并对SYBRGREENΙPCR法的灵敏性、特异性、重复性等进行分析。结果最适退火温度为55℃,最适引物浓度为0.5μmol/L。用该方法检测2株SIN病毒株YN87448和XJ160结果均为阳性,而对其他虫媒病毒如甲病毒属Geta病毒、乙脑病毒、Batai病毒、Banna病毒、环状病毒及西方马脑炎病毒合成模板检测时结果均为阴性。根据病毒空斑形成实验结果,将YN87448病毒悬液进行连续10倍稀释后分别用常规PCR和SYBRGREENΙ荧光PCR方法进行检测。结果SYBRGREENΙ荧光PCR检测敏感性比常规PCR方法要高近100倍,检出下限可达0.1PFU/ml。对模拟感染的人血清标本检测结果表明人血清中成分对检测体系无明显影响。对151份不明原因发热和病毒性脑炎患者的血清或脑脊液标本进行检测,结果检测到6份标本阳性。结论本实验建立了辛德毕斯病毒特异性核酸的SYBRGREENΙ荧光PCR检测方法,实验结果显示了较好的特异性、广谱性,初步证实可应用于临床标本的检测,为将来用于临床和调查辛德毕斯病毒在我国的流行情况提供了新的技术手段。     

持续表达乙脑病毒亚病毒颗粒的一株哺乳动物细胞系的传代和特性

该作者已经培养了一株产生乙脑病毒 (JEV)亚病毒颗粒 (胞外颗粒 EPs)的分泌型的细胞系 (F细胞系 ) ,该颗粒包括 JEV的外膜糖蛋白 (E)和病毒体细胞膜蛋白 (M)的前体。F细胞从编码突变型的 Pr M c DNA加工合成的 JEV产物 ,因为表达 E蛋白和 Pr M蛋白的真正结构的稳定细胞系不能被获得 ,部分是由于包括 E和 M的 EPs的细胞融合能力。对于 EPs分泌细胞系的成功产生 ,Pr M蛋白的生化转换是严格的。F细胞产生的 EPs表现了 JEV感染细胞产生的空病毒颗粒的生化特性 ,除了 F细胞的 EPs。缺乏凝血活性和 M。 F细胞 Eps能被一组抗 E蛋…     

引起严重神经后遗症的Lacrosse脑炎

La Crosse脑炎 ,属加利弗尼亚虫媒病毒组成员 ,是美国报道的蚊媒病最常见的病因。每年约有 70例 LaCrosse脑炎病毒例的报道。主要的传播媒介为伊蚊。夏季 ,病毒在一些小哺乳动物如金花鼠和松鼠中垂直增殖。尽管盛有水的人造容器和旧轮胎提供了一个适合繁殖的条件 ,感染的雌性伊蚊在硬木树的底部树洞里产卵。一些感染了 La Crosse病毒的卵在第二年春天孵化 ,增加了感染病毒的成年伊蚊数量 ,而且宿主媒介循环重新开始。人感染 La Crosse病毒后 ,只有少数感染病毒的儿童发病。该病毒引起的临床症状是较轻的 ,而且神经后遗症相对不常见。在…     

2008年辽宁省乙脑病毒分离株全基因组特征分析

目的 对2008年分离自辽宁蚊虫的乙脑病毒株进行全基因组序列测定和分析,了解其全基因组特征.方法 使用针对乙脑病毒全基因组测序引物,RT-PCR扩增片段,完成对病毒全基因组序列的测定.应用Chstal X(1.83)、ATGC(V4)、DNAStar、GENEDOC(3.2)、Mega(4.0)等生物学软件完成全基因组核苷酸和氨基酸序列分析及病毒的系统进化分析.结果 乙脑病毒LN0828株基因组全长10 965个核苷酸,其中从97位到10 392位为开放读码框,编码3432个氨基酸.与GenBank中的32株乙脑病毒在全基因组水平的核苷酸总体差异率为1.6%～16.4%,氨基酸总体差异率为0.3%～5.1%.与减毒活疫苗株SA14-14-2相比,编码区共存在1186个核苷酸差异,86个氨基酸差异.全基因组序列系统进化分析显示LN0828株属于基因Ⅰ型乙脑病毒.结论 与该地区2002年和2007年乙脑病毒分离株高度同源,关键位点氨基酸未见变异.     

云南省病毒性脑炎和不明原因发热患者的相关病毒IgM抗体检测及分析

目的 调查云南省病毒性脑炎和不明原因发热病例的发病病因.方法 在云南省部分地区采集病毒性脑炎和不明原因发热患者血清和脑脊液标本,用ELISA法检测患者标本中包括虫媒病毒、肠道病毒和呼吸道病毒中15种病毒的IgM抗体.结果 在云南省共采集病毒性脑炎患者血清和脑脊液标本526份,不明原因发热患者血清标本221份.经ELISA法检测,病毒性脑炎患者标本中乙型脑炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、版纳病毒、单纯疱疹病毒、腮腺炎病毒、登革热病毒和罗斯河病毒的IgM抗体阳性率依次为50.95％(阳性数=268)、21.48％ (113)、19.58％(103)、7.41％ (39)、3.04％(16)、1.71％(9)、1.00％(5)和0.38％(2);不明原因发热患者血清中乙型脑炎病毒、登革热病毒、单纯疱疹病毒、版纳病毒、腮腺炎病毒、柯萨奇病毒、埃可病毒、罗斯河病毒和巴马森林病毒的IgM抗体阳性率依次为21.27％ (47)、20.36％ (45)、13.12％(29)、12.67％ (28)、11.76％ (26)、4.52％(10)、1.81％(4)、1.81％(4)和0.45％(1).乙型脑炎病毒、登革热病毒、版纳病毒、罗斯河病毒和巴马森林病毒感染以7-10月为主,柯萨奇病毒、埃可病毒、单纯疱疹病毒和腮腺炎病毒感染以7-8月居多.结论 乙型脑炎病毒是云南省夏秋季病毒性脑炎流行的主要病原体,柯萨奇、埃可和单纯疱疹病毒是散发性病毒性脑炎的重要病原;登革、版纳、单纯疱疹和腮腺炎病毒是不明原因发热的重要病毒病原并可能存在罗斯河和巴马森林等蚊媒病毒的流行.     

Banna病毒TaqMan探针法RT-PCR检测方法的建立

目的 建立Banna病毒核酸特异的快速、敏感的TaqMan探针RT-PCR检测方法。方法 首先对从GenBank中检索到的所有Banna病毒的序列进行同源性分析及引物、探针的设计。病毒在BHK21细胞或C6／36细胞上繁殖扩增后提取病毒RNA和逆转录。以cDNA为模板分别进行TaqMan探针法RT-PCR和传统的PCR检测，并对方法的种内广谱性和特异性、检测灵敏性以及用于蚊虫和临床标本的适用性等进行评价。结果 Banna病毒核酸特异的TaqMan探针RT-PCR检测方法具有较好的种内广谱性和特异性，可以检出所有12株Banna病毒，而其他虫媒病毒如辛德毕斯病毒、乙型脑炎病毒、bated病毒和环状病毒检测结果均为阴性。与传统PCR相比，敏感性高100倍以上，可以检出每50止标本中含有0.5CCID50的Banna病毒。单链RNA变性条件（65℃）进行逆转录使检测结果的敏感性比99℃变性法最少低10倍。病毒在室温保存1天和4℃保存1周后，检出敏感性会比原来低10倍左右。该方法在检测模拟感染Banna病毒的人血清标本以及蚊虫标本时，均显示出较好的特异性。112份蚊标本中检出6份标本阳性，4份可疑阳性，病毒分离结果3份阳性。结论 本实验成功建立了Banna病毒特异性核酸的TaqMan探针RT-PCR检测方法，并初步证实可用于血清标本和媒介蚊虫标本的检测，为开展Banna病毒的流行监测及临床早期诊断提供了新的技术手段。     

我国Colti病毒基因分型的研究

目的 对我国分离的Colti病毒进行基因分型。方法 采用针对Colti病毒B2亚组第9和12片段和B1亚组第12片段的3对引物，对我国近年来分离的Colfi病毒利用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法进行基因分型。同时对北京分离株BJ95-75和云南分离株YN-6的PCR产物进行了克隆测序及同源性分析。结果 Colfi病毒北京分离株BJ95-75、云南分离株YN-6、-67-1、-68-1、-69、-70-1、-70-2、-90、-92-2、-93病毒用B2亚组特异引物12-854-S/12-B2-R均能得到相对分子质量为850bp的特异条带，用针对于第9片段的B2亚组引物9-JKT-S／9-JKT-R均得到了相对分子质量为492bp的特异条带。而Colti病毒东北分离株NE97-12、NE97-3l及对照病毒如环状病毒YN-99、乙脑病毒YN-151-1未能扩出特异条带。所有Colti病毒分离株及病毒对照用Bl亚组特异引物12-B1-S/12-B1-R均未见特异条带。BJ95-75、YN-6这2株病毒第12片段核苷酸序列与B2亚组其他毒株间的同源性达到89．4％以上，特别是与中国早期分离株Banna病毒，其同源性达到98．9％以上；2株病毒第9片段的核苷酸序列与属于B2a型的Banna病毒的同源性可达到99．2％和96．5％，和JKT6423病毒的同源性也能达到84．0％，而与属于B2b型的JKT6969和JKT7043相应片段核苷酸序列的同源性只有53．0％左右。结论 首次对我国分离的Cohi病毒从分子水平上进行了研究，证实了PCR方法对Colti病毒进行基因分型的可行性，北京和云南分离株主要为B2亚组的B2a型。吉林分离株NE97-12、NE97-3l的正确分型还要依赖于将它们基因组的特定片段进行全序列分析的完成。     

乙型脑炎病毒TaqMan PCR检测方法的建立及初步应用

目的 利用TaqMan PCR技术，建立乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）实时荧光PCR检测方法，初步应用于蚊虫媒介的JEV监测。方法根据GenBank发表的JEV全基因组序列资料分析结果，在其NS5基因区段设计JEV特异的引物与探针；优化Mg^2＋浓度和引物浓度比例，并利用11株JEV和7株相关病毒株考核检测体系的保守性、特异性、灵敏性和稳定性；利用体外转录的病毒RNA和定量的病毒样品，建立相应的定量分析模型；初步应用于蚊虫媒介的监测与检测分析。结果Mg^2＋优化浓度为5mmol／L，上下游引物浓度比例为4：1，引物探针具有良好的保守性和特异性，灵敏度为10PFU／ml，稳定性分析表明，同一样品Ct值的重复检测5次，变异系数均小于5％；绘制两种标准曲线，构建了JEV基因拷贝数、病毒滴度为分析指标的定量分析模型，检测蚊虫标本结果显示，TaqMan PCR方法较病毒分离法敏感、快捷、简便。结论本研究建立了一种灵敏、特异、简便易行的JEVTaqMan PCR检测方法，为蚊虫媒介检测奠定了基础，为乙型脑炎的预防控制和脑炎相关疾病的诊断与鉴别诊断提供了一种技术手段。     

我国首次分离巴泰病毒的分子生物学鉴定

目的对从云南蚊虫中分离的YN924病毒进行分子生物学鉴定,从分子生物学水平明确其分类地位。方法扩增YN924病毒的S片段并测序,通过ClustalX(1.8)、Phylip、Treeview(3.2)软件对S片段的序列进行分析,并构建种系发生树;对S片段编码产物N蛋白及NSs蛋白的氨基酸顺序进行分析。结果用两对引物均可从YN924病毒扩增出产物,序列分析发现S片段与巴泰病毒(X73464)的同源性最高,为96.4%;N蛋白、NSs蛋白的氨基酸顺序与巴泰病毒的同源性分别为99.1%和98%。结论从云南分离的YN924病毒属于巴泰病毒,我国首次对该病毒进行分子生物学鉴定。     

在内蒙古蚊虫中分离到版纳病毒

目的 鉴定内蒙古通辽市分离的虫媒病毒.方法 使用血清学及分子生物学方法鉴定内蒙古蚊虫标本分离的病毒,对毒株的部分核苷酸序列进行测定,应用Clustal X软件做碱基配对分析,MEGA软件完成病毒进化分析,DNAStar软件包中的MegAlign完成核苷酸和氨基酸同源性分析.结果 在内蒙古通辽市采集凶小库蚊标本分离的病毒经过血清学和分子生物学实验鉴定为版纳病毒(Banna virus,BAV),与版纳病毒部分中国分离株位于同一进化分支中,病毒第12片段核苷酸同源性为89.6%～98.4%,氨基酸同源性为90.4%～98.6%.结论 在内蒙古凶小库蚊标本中分离到版纳病毒.