兔骨髓间充质干细胞分离培养及向成骨细胞表型的诱导分化

目的观察兔骨髓间充质干细胞(MSC)体外培养增殖的生长特征及体外诱导条件下的成骨能力情况.方法抽取兔髂骨及胫骨的骨髓液,经密度梯度离心分离出MSC,用塑料培养板贴壁培养进一步纯化MSC,并培养增殖.观察MSC的生长特征,测定其生长曲线及贴壁率.对第2代MSC进行成骨矿化诱导,测定其碱性磷酸酶(ALP)活性及成骨矿化情况.结果MSC为贴壁生长,以均一的梭形的成纤维细胞样生长,增殖能力强.在成骨诱导剂作用下,MSC具有成骨能力,诱导后ALP活性明显提高,并且出现矿化结节.结论获得的兔骨髓MSC生长增殖旺盛,分离培养MSC是可行的,且MSC具成骨分化潜能.     

大鼠骨髓间充质干细胞的分离冻存及向成骨细胞和软骨细胞诱导分化

目的 建立大鼠骨髓间充质干细胞（MSC）体外分离、纯化、增殖、冻存的方法,并观察其体外分化为成骨细胞及软骨细胞的潜能活性.方法 取SD大鼠的股骨及胫骨,冲取骨髓液,采用密度梯度离心法结合贴壁培养法以及单独用贴壁培养法分离纯化MSC,增殖,并测定其生长曲线.MSC在12.5%DMSO条件下经液氮冻存半年复苏,测其存活率.对第3代大鼠MSC进行成骨矿化诱导,测定其碱性磷酸酶（ALP）活性及成骨矿化情况.对第3代大鼠MSC进行诱软骨细胞的诱导分化,测定诱导后的细胞表型情况.结果 大鼠MSC为均一的梭形的成纤维细胞样生长,贴壁及增殖能力强,生长曲线呈S型.MSC于液氮冻存半年后复苏,其存活率为80%.在成骨诱导剂作用下,MSC具有成骨能力,诱导后ALP活性显著提高,并出现矿化结节沉积.在成软骨诱导剂作用下,可见细胞由成纤维细胞样的梭形变为椭圆形及肾形,并分泌异染基质,甲苯胺蓝染色呈阳性,表现为软骨细胞分化特点.结论 获得的SD大鼠MSC生长旺盛,增殖能力强.在特定诱导条件下,大鼠MSC体外可定向分化为成骨细胞及软骨细胞,具有成骨及成软骨分化潜能.     

克隆化兔骨髓基质干细胞系的建立及其生物学特性研究

目的 建立克隆化兔骨髓基质干细胞（MSC）系，并对其生物学特性进行研究，为组织缺损修复寻找理想的种子细胞提供新的途径。方法 应用密度梯度离心和贴壁分离培养方法，从兔骨髓中获得原代骨髓MSCs，再应用克隆化分离培养技术，建立克隆化扩增的骨髓MSC系。体外传代培养、低温冻存复苏、形态学观察、生长曲线测定、染色体分析和分化潜能鉴定。结果 建立了一株克隆化兔骨髓MSC系。该细胞系在含10％胎牛血清的LG-DMEM中连续传代至第32代，仍保持旺盛的增殖能力，P4和P32代细胞染色体众数保持稳定的二倍体核型，成骨细胞诱导试验阳性。结论 获得一株具有旺盛的增殖能力和分化潜能，遗传性能稳定的克隆化兔骨髓MSC系。     

不同冻存时间与温度对兔骨髓基质干细胞存活率的影响

目的：以二甲基亚砜作为保护剂，采用慢冻快融法观察不同温度及不同时间冻存的免骨髓基质干细胞复苏后存活率的变化。 方法：实验于2003-09／2005—06在浙江省医学科学院生物工程所完成。①选取清洁级3月龄新西兰大白兔5只，抽取兔髂骨及胫骨的骨髓液，密度梯度离心法结合贴壁培养法分离纯化出兔骨髓基质干细胞，并进行增殖。②取第3代骨髓基质干细胞，经消化后离心重悬，用完全培养液调整细胞浓度为6&;#215;10^9L^-1。将质量浓度为250g／L的二甲基亚砜缓慢滴入同体积含骨髓基质干细胞的上述培养液中，混匀，二甲基亚砜的终浓度为125g／L，骨髓基质干细胞的终密度为3&;#215;10^9 L^-1，1mL／安瓿冻存。③4℃冻存直接将安瓿置4℃冰箱中；-20℃及-60℃冻存，则将安瓿置于有脱脂棉的聚丙烯泡沫盒中，壁厚1．5cm，扎紧密封，各置-20℃及-60℃冰箱过夜，取出后分别直接放于-20℃及—60℃冰箱保存；-196℃液氮冻存，则将置有安瓿的泡沫盒于-60℃冰箱过夜后，取出冻存安瓿直接放于液氮中保存。骨髓基质干细胞分别于4℃、-20℃、-60℃、-196℃条件下进行3d，10d，1，3，8个月以及1年的冻存。④经不同温度及不同时间冻存后，给予复苏。复苏时将冻存安瓿从液氮或冰箱中取出，立即置37℃水浴并轻轻摇动，约1min迅速解冻。含骨髓基质干细胞的冻存液经5倍于冻存液量的完全培养液稀释后，离心重悬，进行骨髓基质干细胞存活率测定。复苏后的骨髓基质干细胞以1&;#215;10^4／cm^2用完全培养液再培养，观察骨髓基质干细胞的形态变化及生长活性情况。结果：实验选取3月龄新西兰大白兔5只，全部进入结果分析。①兔骨髓基质干细胞原代培养情况：培养3d时，骨髓基质干细胞数量较少，散在分布，呈短梭形形态。培养1周时细胞形成大量的小集落，细胞变长。此后集落细胞迅速增多，逐渐汇合成片，形态为均一的长梭形，呈旋涡状排列，2周时细胞长成单层。②兔骨髓基质干细胞传代培养情况：刚传代的骨髓基质干细胞呈圆形，数小时后迅速贴壁，重新成为梭形。之后细胞呈长梭形均匀分布生长，形态比原代培养更均一，细胞生长旺盛、增殖迅速。连续传代22代无明显变化。但随传代次数增多，细胞形态出现多样性，逐渐呈老化现象。③不同温度不同冻存时间下复苏后的兔骨髓基质干细胞存活率的比较：兔骨髓基质干细胞液氮保存1年，存活率为79％；-60℃保存1，3，8个月的存活率分别为67％，38％和0％；不宜于4℃及-20℃保存。（少复苏后的骨髓基质干细胞再培养情况：复苏后的骨髓基质干细胞细胞形态及生长状况与冻存前无明显差异，呈长梭形生长，增殖旺盛。 结论：分离纯化的兔骨髓基质干细胞生长增殖能力强，短期保存可用-60℃冻存，长期需液氮保存，为择期进行骨髓基质干细胞实验和应用提供实验依据。     

可梯度降解支架细胞化后修复兔前交叉韧带缺损

目的 通过可梯度降解的绳-网支架复合自体骨髓间充质干细胞(MSCs),修复兔前交叉韧带(ACL)缺损。 方法 将聚乳酸: 蚕丝丝素: 聚羟基乙酸纤维按质量比7: 6: 5混合,分别捻拧成绳芯与纬编针织成网状物,滴加Ⅰ型胶原并冻干。将网状物包裹绳芯,种植兔自体MSCs,植入兔前交叉韧带(ACL)缺损处,作为实验组。单纯支架置入为对照组。分别于术后12、24周,取材,HE染色,并行力学测试。 结果 术后12周,实验组新生韧带与骨之间产生大量有序的垂直胶原纤维;对照组形成少量垂直胶原纤维。术后24周,实验组形成类似直接止点结构;对照组则产生许多垂直胶原纤维。力学测试结果显示,术后12、24周实验组的最大载荷分别为72.7±23.4N与121.8±34.3N,与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。 结论 可梯度降解支架复合自体MSCs能较好地重建兔ACL。     

包裹转化生长因子β1壳聚糖缓释微球的研制

目的:制备包裹转化生长因子β1的壳聚糖微球,并分析其各种特性.方法:将壳聚糖溶解在2%乙酸中,利用吐温-80作为乳化剂,多聚磷酸钠作为交联剂,以乳化交联法制备载有转化生长因子β1的壳聚糖微球;同时制作空壳聚糖微球以及包裹牛血清白蛋白的壳聚糖微球作为空白对照和实验对照.对获得的3种冻干微球的形态,直径大小进行观察,对转化生长因子β1壳聚糖微球的分散情况及所载药物的体外释放情况进行检测,并测定空壳聚糖微球及包裹牛血清白蛋白壳聚糖微球的吸水膨胀率.结果:冻干后的微球经过扫描电镜观察后发现:空壳聚糖微球直径约15 μm,表面光滑,有较多微小孔隙,而包裹了牛血清白蛋白及转化生长因子β1的壳聚糖缓释微球直径约为1 μm,大小较均一,表面光滑.包裹了转化生长因子β1的壳聚糖微球在释放实验中前12 h内释放速度较快,随后趋于平缓.6 d内微球的转化生长因子β1释放率为53.5%.壳聚糖微球及包裹了牛血清白蛋白的壳聚糖微球在1 h后增加的质量基本达到平衡,均超过700%,且发现微球越是在酸性环境中,吸水膨胀率越高.结论:实验采用乳化交联法制备包裹转化生长因子β1的壳聚糖缓释微球的方法简单易行,成球性好,得率高,具有良好的缓释效果.且壳聚糖微球的超强吸水膨胀率对软骨组织工程支架提出了孔径大小及强度的要求.     

蚕丝/聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架降解液与骨髓间充质干细胞的增殖

背景：前期研究表明,蚕丝/聚乳酸-羟基乙酸共聚物支架浸提液具有良好的细胞相容性,基本无细胞毒性。 目的：观察蚕丝/聚乳酸-羟基乙酸共聚物纤维细丝混合编织支架体外长期降解过程中降解液对兔骨髓间充质干细胞增殖活性的影响。 方法：将蚕丝/聚乳酸-羟基乙酸共聚物细丝混合编织支架材料置于完全培养基中体外降解14周,每周换液1次,测定各周支架降解液的pH值。将兔骨髓间充质干细胞分组培养,实验组加入各周支架降解液和新鲜完全培养基各100 µL,阴性对照组加入完全培养基200 µL,培养4 d。MTT法检测细胞增殖、生长情况。 结果与结论：①支架降解液pH值的变化：前3周下降缓慢,从7.00降到6.89;第4周起下降较快,6-11周较低,在5.16-5.67之间;12-14周呈上升趋势,回升到6.95。②骨髓间充质干细胞形态：实验组及阴性对照组细胞增殖生长及形态状况基本相似。降解7-10周支架降解液对细胞的生长有抑制作用,细胞数量相对较少、较疏,而其余各周支架降解液对细胞生长无明显抑制作用。③骨髓间充质干细胞的增殖：1-6周及11-14周的支架降解液对细胞增殖无显著影响,细胞相对增殖率均在92.1%以上,毒性分级为0或1级;7-10周的支架降解液虽对细胞增殖有抑制作用,但细胞相对增殖率为82.5%-87.9%,毒性分级为1级,为合格。表明蚕丝丝素/聚乳酸-羟基乙酸共聚物混合编织支架降解液具有良好的细胞相容性。     

抗人AFP单克隆抗体酶联免疫检测法的建立及其应用

报道用抗人甲胎蛋白(AFP)单克隆抗体(McAb)标记辣根过氧化物酶(HRP),以纯化之免抗人AFP多克隆抗体包被徽孔条板,建立用于检测血清中AFP的酶联免疫法。结果表明:该方法具有特异、敏感(10ng/ml)、重复性好(变异系数<10％)和简便等优点。在204例临床血清标本的检测中,本方法与放射免疫法(RIA)的结果相符合。     

抗人AFP单克隆抗体酶联免疫检测法的建立

本文报道用抗人甲胎蛋白单克隆抗体标记辣根过氧化物酶以纯化之兔抗人ＡＦＰ多克隆抗体包被微孔条板，建立用于检测血清中ＡＦＰ的酶酶免疫法。结果表明：该方法具有特异、敏感、重复性好（变异系数〈１０％）和检测范围宽的优点。在８６例临床血清标本的检测中，本方法与放射免疫法的结果相结合。